一种具有增强FcRn受体结合的突变子制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体提供一种具有增强FcRn受体结合的人IgG Fc片段的突变子，其中所述突变子包含M252、Q311、M428、N434、或Y436，或它们中的两个或两个以上突变位点的突变。本发明专利技术提供的Fc突变子具有增强FcRn受体亲和力，免疫原性较低，不增加安全性风险，有潜在的临床应用价值。的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种具有增强FcRn受体结合的突变子


[0001]本专利技术属于生物医药领域，特别涉及一种具有增强FcRn受体结合的突变子及其在延长Fc融合蛋白或免疫球蛋白半衰期等领域的潜在应用价值。

技术介绍

[0002]近年来单抗及Fc融合蛋白作为治疗药物的用途显著增加，已应用到不同的治疗领域包括癌症、内分泌领域、骨质疏松、内风湿关节炎、心脑血管及超级细菌感染等，单抗及Fc融合蛋白在人体内的清除速率可直接影响该蛋白的剂量及给药频率，单抗及Fc融合蛋白的快速清除不仅增加患者的医疗成本，同时降低患者依从性。
[0003]单抗及Fc融合蛋白抗体蛋白的生物物理性质、抗原结合能力、糖基化修饰、水解稳定性、所结合抗原的性质(如膜蛋白、游离蛋白、抗原含量等)都会影响抗体的分布和清除。研究发现血管内皮细胞上广泛分布的FcRn受体(Neonatal Fc Receptor)对抗体及Fc融合蛋白的体内半衰期起着关键作用，FcRn受体的存在使得循环的IgG及Fc融合蛋白的血清半衰期较长。FcRn受体可以和单抗及Fc融合蛋白的Fc区域有特异性结合，但是这一结合能力受pH值的调节。Fc融合蛋白及抗体分子等均可被细胞通过胞饮作用摄取，一旦蛋白被内吞，FcRn受体通过在酸性pH(pH6.0)条件下与抗体或Fc融合蛋白高亲和力结合并且随后将抗体或Fc融合蛋白通过胞吐作用释放至血液循环系统，胞吐时pH与血液循环系统一致(pH7.4)，此时抗体或Fc融合蛋白与FcRn的亲和力大大降低，因此可顺利地从细胞膜上释放出来。在胞吞过程中一部分抗体或Fc融合蛋白未能与FcRn结合或结合过程中脱落，进而被带入溶酶体并被降解。
[0004]因此，理论上通过增强抗体和Fc融合蛋白的Fc片段和FcRn的结合力可以降低抗体蛋白在内皮细胞中被降解的几率，进而延长蛋白在体内的半衰期，Takuo Suzuki等人总结多个Fc融合蛋白和单克隆抗体的PK 数据，也证实了通过增强抗体或Fc融合蛋白与FcRn的亲和力可延长蛋白在体内的半衰期。Acqua等人描述了针对小鼠FcRn的人IgG1铰合部
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Fc片段噬菌体展示文库的随机诱变和筛选。他们发现IgG1
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人FcRn 复合体稳定性的主要改善存在于定位在横跨Fc
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FcRn界面带中的氨基酸残基(M252、S254、T256、H433、 N434和Y436)，且以较小的程度存在于外周残基如V308、L309、Q311、G385、Q386、P387和N389的取代。通过组合M252Y/S254T/T256E和H433K/N434F/Y436H突变获得了对人FcRn具有最高亲和力的变体，且相对于野生型IgG1显示亲和力增加57倍。
[0005]Hinton等描述了两个突变T250Q和M428L，其分别使人IgG2与人FcRn的结合增加约3倍和7倍。组合时，这两个突变诱导IgG2的结合能力增加28倍。注射至猕猴进行药物代谢动力学研究时，两个IgG2 突变体M428L和T250Q/M428L都显示比野生型抗体长约2倍的半衰期。
[0006]但是仅提高pH6.0下的FcRn受体亲和力，不一定能够获得半衰期延长的候选蛋白，Genentech公司YikAndy Yeung等人通过体外筛选发现在pH6.0条件下突变子N434W(亲和力为野生型的80倍)与FcRn受体的亲和力明显高于N434A(亲和力约为野生型的4倍)，但是
在食蟹猴体内的pK数据表明，可知N434A在体内半衰期、AUC明显优于野生型和N434W突变子，N434W突变子在食蟹猴体内的pK数据与野生型基本一致，经分析虽然N434W在pH6.0下与FcRn的亲和力显著提高，但是同时也提高了在pH7.4下的FcRn 亲和力，最终导致其体内半衰期并未延长。Medimmune公司William F.Dall
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Acqua等人也佐证了pH7.4 亲和力数据的重要性，通过对噬菌体文库筛选，在YTE技术平台的基础上，对Fc蛋白的432
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437区域进行了饱和突变，筛选到多个pH6.0下亲和力较YTE更强的突变子，研究人员分别评估了这些突变子在pH6.0 及pH7.4下与人FcRn亲和力，其中N3E
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YTE突变子pH6.0下亲和力显著增强，但是其pH7.4下亲和力也显著提高。筛选到的突变子在转基因小鼠(表达人FcRn受体)体内的pK数据可知，N3E
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YTE在小鼠体内的清除速率最快，β相半衰期与野生型相近，但AUC显著低于野生型。
[0007]专利申请CN101910199A公开了一种包含相对于野生型人Fc区的至少一个修饰的变体Fc区，例如选自由下列组成的组：252Y/428L、252Y/434S和428L/434S，并给出了多种具体的变体Fc区。但是，该专利申请公开的Fc变体的亲和力仍需进一步提升。
[0008]专利申请CN109071631A公开了一种组合物，其包括对FcRn具有改变的结合亲和力的治疗免疫球蛋白，所述免疫球蛋白在Fc区域中包括至少一种突变，例如在选自311、434、428、438和435中的一个或多个位置处的突变，并给出了多种具体的突变Fc区。但是，该专利申请公开的治疗免疫球蛋白的亲和力仍需进一步提升。
[0009]综上所述，本领域中仍然存在对新的优化的Fc突变子的需要。

技术实现思路

[0010]本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有增强FcRn受体结合的突变子及其在延长Fc融合蛋白或免疫球蛋白半衰期等领域的潜在应用价值。
[0011]本专利技术的另一目的在于提供一种具有增强FcRn受体结合的突变子，所述Fc突变子可显著增强与FcRn 受体在pH6.0下的亲和力，同时在pH7.4下与FcRn亲和力与野生型相当或低于野生型，预期Fc突变子在体内通过与血管内皮细胞上的FcRn受体结合后进入细胞内循环，可显著延长Fc突变子在体内的半衰期。
[0012]本专利技术的另一目的在于提供一种具有增强Fc受体亲和力的且免疫原性较低的突变子，通过计算机模拟及小鼠强制免疫评价ADA方式获得多个ADA平均OD值与野生型相当的突变子，该突变子在体内免疫原性与野生型相当，不增加安全性风险，有潜在的临床应用价值。
[0013]本专利技术提供了具有增强FcRn受体结合的人IgG Fc片段的突变子。具体专利技术如下：
[0014]本专利技术提供了一种具有增强FcRn受体结合的人IgG Fc片段的突变子，其中所述突变子包含M252、 Q311、M428、N434或Y436，或它们中两个或两个以上突变位点的突变，
[0015]作为同时两个突变位点突变的示例性说明，所述突变子包括M252和Q311、M252和M428、M252 和N434，M252和Y436，Q311和M428、Q311和N434，Q311和Y436；M428和N434，M428和Y436， N434和Y436的突变位点的突变；
[0016]作为同时三本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有增强FcRn受体结合的人IgG Fc片段的突变子，其中所述突变子包含M252、Q311、M428、N434或Y436，或它们中两个或两个以上突变位点的突变；所述IgG Fc片段包括人IgG1 Fc、IgG2 Fc或IgG4 Fc片段。2.根据权利要求1所述的突变子，其特征在于，所述M252突变位点的突变为M252Y。3.根据权利要求1所述的突变子，其特征在于，所述Q311突变位点的突变选自Q311K、Q311S或Q311L。4.根据权利要求1所述的突变子，其特征在于，所述M428突变位点的突变为M428L。5.根据权利要求1所述的突变子，其特征在于，所述N434突变位点的突变选自N434Y、N434W、N434F、或N434L。6.根据权利要求1所述的突变子，其特征在于，所述Y436突变位点的突变选自Y436I、Y436L或Y436T。7.根据权利要求1所述的突变子，其特征在于，所述突变子进一步选自：
8.根据权利要求7所述的突变子，其特征在于，所述突变子具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44的氨基酸序列。9.根据权利要求7所述的突变子，其特征在于，所述突变子进一步选自：
突变位点Q311L；M428L；N434Y和Y436LM252Y；Q311L；M428L；N434Y和Y436LM428L；N434Y和Y436L；M252Y；M428L；N434W和Y436IM252Y；N434Y和Y436IQ311L；M428L和N434WM252Y；M428L；N434F和Y436IQ311L；M428L；N434F；Y436IM252Y；Q311L；M428L；N434Y和Y436IQ311S；M428L；N434W和Y436IM252Y；Q311L；N434W和Y436IQ311S；M428L和N434WM252Y；Q311S；M428L和N434WQ311S；M428L；N434Y和Y436IM252Y；和N434WM252Y；N434W和Y436LM252Y；Q311L和N434WQ311L；M428L；N434Y和Y436IM428L；N434W和Y436IM252Y；M428L和N434WQ311L；M428L；N434W和Y436IM252Y；M428L；N434Y和Y436LM252YN434W；和Y436IQ311L；N434W和Y4361Q311L和N434WM252Y；N434F和Y436I，或M252Y和N434Y10.根据权利要求9所述的突变子，其特征在于，所述突变子具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹春来，刘合栋，黄国周，杨晓纯，李张万金，梁雄基，樊昌，周翠，何秀仪，李素雯，张鹏，梁芷瑜，
申请(专利权)人：珠海联邦制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：