一种重组益生菌及其菌粉的制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种重组益生菌及其菌粉的制备方法与应用，该重组益生菌通过外源基因的表达生成谷蓝；上述外源基因包括蓝色素合成酶基因和4

【技术实现步骤摘要】
一种重组益生菌及其菌粉的制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种重组益生菌及其菌粉的制备方法与应用。

技术介绍

[0002]近年来，在规模化养殖场中，腹泻性传染病发病增多，已逐渐成为养殖动物生长受阻和死亡率高的主要原因。以仔猪为例，引起仔猪腹泻传染病的病原多种多样，主要包括病毒性感染、细菌性感染、寄生虫性感染等，其中以细菌性感染最为常见，每年在死亡的仔猪中约有50％与埃希氏大肠杆菌有关。目前，疫苗和益生菌制剂进行防治最为引人注目。然而由于产肠毒素大肠杆菌血清型多，变异性大，抗原复杂，实际使用疫苗效果反应不一，而且存在成本高，运输和保存条件要求也较高，且使用减毒活疫苗有体内返毒的风险。因此，疫苗的大规模推广困难较大。
[0003]益生菌作为一种活菌制剂，具有促进营养物质代谢吸收，刺激动物免疫系统，增强动物抗病能力，特别是肠道益生菌，可以促进动物肠道免疫系统的发生发展且具有绿色无残留等优点，受到各国研究者的广泛关注。
[0004]以枯草芽孢杆菌为例，其自身产生的蛋白酶、淀粉酶等可将饲料中的淀粉、蛋白质等肠道不易吸收的营养成分降解为葡萄糖、氨基酸等小分子，可促进养殖动物对饲料的消化、吸收，促进养殖动物对饲料的消化、吸收，提高饲料利用率；同时，枯草芽孢杆菌自身产生的乳酸等物质可对大肠杆菌起到较好的抑制作用。
[0005]目前，已有益生菌作为饲料添加剂降低养殖动物腹泻率的相关研究，围绕益生菌添加形成的微生态制剂也是畜牧养殖优化的一个重要研究方向。但已知益生菌多用于人体保健，针对动物需求进行强化的益生菌开发工作目前较为空缺。
[0006]谷蓝(CAS#：2435
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59
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8)是一种微生物天然蓝色产物，因其具有颜色鲜艳、无毒无害等特性，常被应用于纺织业染色工艺。但谷蓝本身也具有较好的抗氧化活性，对1,1
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二苯基
‑2‑
苦基肼自由基(DPPH)、超氧化物自由基等具有较好的清除效果；谷蓝也能够通过干预部分炎症相关分子的表达起到抗炎的效果；谷蓝还能够通过产生超氧化物和羟基自由基的机制，显著地抑制金黄葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌等致病菌种。但由于谷蓝是一种非水溶性物质，可以表达的天然菌株多为致病菌或海洋微生物，不能直接用于动物喂养。
[0007]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种重组益生菌及其菌粉的制备方法与应用，通过将该重组益生菌制备为菌粉添加到饲料中，可以降低养殖动物腹泻的发病概率，改善其肠道健康，提高生产性能，减少经济损失。
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供了一种重组益生菌，其通过外源基因的表达生成谷蓝；外源
基因包括蓝色素合成酶基因和4
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磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶合成基因。
[0011]在一些实施方式中，蓝色素合成酶基因包括indigoidine synthase IndC、Blue
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pigment synthetase、putative indigoidine synthase IndC。
[0012]在一些实施方式中，蓝色素合成酶基因选自indigoidine synthase IndC(NCBI.Gene.ID：61359656)、Blue
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pigment synthetase(NCBI.Gene.ID：15402259)或putative indigoidine synthase IndC(NCBI.Gene.ID：10467378)中的至少一种。
[0013]具体地，蓝色素合成酶基因indigoidine synthase IndC(NCBI.Gene.ID：61359656)来源自Pseudoalteromonas rubra菌属的DSM 6842的基因；蓝色素合成酶基因Blue
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pigment synthetase(NCBI.Gene.ID：15402259)来源自Streptomyces fulvissimus菌属的DSM 40593的基因；蓝色素合成酶基因putative indigoidine synthase IndC(NCBI.Gene.ID：10467378)来源自Burkholderia gladioli菌属的BSR3的基因。
[0014]在一些实施方式中，4
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磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶合成基因为putative indigoidine synthase IndC(NCBI.Gene.ID：56652119)。
[0015]具体地，4
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磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶合成基因putative indigoidine synthase IndC(NCBI.Gene.ID：56652119)来源自Bacillus tropicus菌属BSR3的基因。
[0016]在一些实施方式中，重组益生菌的宿主选自植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌或丁酸梭菌中的任意一种。
[0017]在本专利技术中，植物乳杆菌选用的是植物乳杆菌SK151；枯草芽孢杆菌选用的是枯草芽孢杆菌WB800；凝结芽孢杆菌选用的是凝结芽孢杆菌TQ33；丁酸梭菌选用的是丁酸梭菌CDC51208，但并不限于上述菌株，相同菌种的其他菌株或者具有类似作用的其他益生菌也在本专利技术的保护范围内。
[0018]在一些实施方式中，上述重组益生菌的构建方法为：将蓝色素合成酶基因和4
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磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶合成基因连接到表达载体上，然后将该重组表达载体导入至宿主益生菌中，即获得重组益生菌。
[0019]在一些实施方式中，上述重组益生菌构建过程中所采用的表达载体包括pET28a(+)、pET23a、pGEX等原核质粒。
[0020]在本专利技术中，对于导入携带上述基因的质粒的方式，这些基因可存在于同一质粒上，或者分别存在于不同的质粒上。
[0021]在一些实施方式中，将蓝色素合成酶基因和4
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磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶合成基因置于一个质粒上进行表达。
[0022]在一些实施方式中，上述重组益生菌的培养方法包括：将重组益生菌的悬浮液接种到培养基中进行活化，再将活化后的菌液进行二次活化，然后将二次活化后的培养液继续发酵直至发酵液中菌株达到适宜浓度时，加入诱导剂，再连续培养。
[0023]具体地，上述活化、二次活化以及发酵步骤中培养条件均为：温度范围为36
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38℃，转速为150
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250rpm；诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷；异丙基硫代半乳糖苷溶液的添加终浓度为180
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220uM；加入诱导剂后连续培养的时间为12h。
[0024]第二方面，本专利技术提供了一种重组益生菌菌粉的制备方法，其包括将上述重组益生菌进行发酵培养，然本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种异源表达有益分子的重组益生菌，其特征在于，所述重组益生菌通过外源基因的表达生成谷蓝；所述外源基因包括蓝色素合成酶基因和4
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磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶合成基因。2.根据权利要求1所述的重组益生菌，其特征在于，所述蓝色素合成酶基因包括indigoidine synthase IndC、Blue
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pigment synthetase、putative indigoidine synthase IndC；优选地，所述蓝色素合成酶基因选自indigoidine synthase IndC(NCBI.Gene.ID：61359656)、Blue
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pigment synthetase(NCBI.Gene.ID：15402259)或putative indigoidine synthase IndC(NCBI.Gene.ID：10467378)中的至少一种。3.根据权利要求1所述的重组益生菌，其特征在于，所述4
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磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶合成基因包括putative indigoidine synthase IndC(NCBI.Gene.ID：56652119)。4.根据权利要求1所述的重组益生菌，其特征在于，所述重组益生菌的宿主选自植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌或丁酸梭菌中的任意一种。5.一种重组益生菌菌粉的制备方法，其特征在于，包括将权利要求1
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4任一所述的重组益生菌进行发酵培养，然后向发酵完成的菌液中加入保护剂，制成料液，再进行喷雾干燥。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述料液中菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：杭州唯铂莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：