一种全血蛋白质组学分析方法技术

本发明专利技术公开了一种全血蛋白质组学分析方法，包括以下步骤：S1、向全血样本中加入结合缓冲液和磁珠，混合孵育后，经过磁分离收集磁珠；S2、向步骤S1所得磁珠中，加入清洗缓冲液，重悬清洗后，经过磁分离收集磁珠，重复该步骤数次；S3、将步骤S2所得磁珠制备成蛋白质组样品，进行质谱检测。本发明专利技术方法应用于全血蛋白组分析，可以简化样本前处理步骤，避免离心分离血浆过程中造成的蛋白损失，对于不能及时处理或不具备离心条件的全血样本也可直接冷冻保存后再检测。后再检测。后再检测。

【技术实现步骤摘要】
一种全血蛋白质组学分析方法


[0001]本专利技术属于蛋白质组学分析
，具体地，涉及一种全血蛋白质组学分析方法。

技术介绍

[0002]血液中包含生物体各类组织器官释放的物质，潜藏着大量可发掘的生理或病理信息。据推测，血液中的蛋白质种类超过万种，但是由于目前检测鉴定技术有限，只有很小的一部分蛋白质可被检测出来。由于血液中含有数十种高丰度蛋白，占了总蛋白量的95％以上，给血液蛋白组的检测带来了巨大的挑战。目前，即使通过使用商业化去高丰度抗体试剂盒，也仅能将蛋白鉴定数提高到400～800个。
[0003]血液样本采集后通常需要通过离心去除血细胞得到上层血浆后，才能进行后续样本制备和质谱检测，否则检测过程中，血细胞容易破裂释放出大量高丰度蛋白，干扰检测结果。同时由于溶血原因，如果不去除血细胞，血液样本无法长期保存。如果全血采样后未能及时处理，或不具备离心分离血浆条件，通常无法继续用于蛋白组学分析。在离心分离血浆的过程中，不可避免地会损失掉部分蛋白信息。同时，由于离心分离血浆过程的操作差异，包括温度、离心力、离心时间在内的各种因素，均可能造成血浆蛋白组信息的人为差异，对血浆蛋白组分析和相关生理病理信息的挖掘产生干扰。。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种全血蛋白质组分析方法，利用纳米材料富集方法，选择性吸附低丰度蛋白，可以同时应用于新鲜采集或冷冻保存的全血样本。处理新鲜全血标本时，可以保护血细胞防止其破裂，从而可以省略血浆分离步骤而直接从全血样本中检测蛋白质组学信息，其结果与血浆样本具有良好的定量相关性。对于不具备及时处理条件的全血样本，冷冻保存后再用本专利技术方法进行样本处理，也可以有效去除样本中血浆和血细胞来源的高丰度蛋白，选择性富集血液标本中的低丰度蛋白，蛋白组分析结果具有较高的蛋白鉴定数及定量稳定性。
[0005]技术方案：为达到上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种全血蛋白质组学分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007]S1、向全血样本中加入结合缓冲液和磁珠，混合孵育后，经过磁分离收集磁珠；
[0008]S2、向步骤S1所得磁珠中，加入清洗缓冲液，重悬清洗后，经过磁分离收集磁珠，重复该步骤数次；
[0009]S3、将步骤S2所得磁珠制备成蛋白质组样品，进行质谱检测。
[0010]步骤S1中，所述全血样本选自不同物种、部位来源的抗凝全血样本，可以为新鲜采集、部分溶血或或冷冻保存的抗凝全血样本，优选冷冻保存的EDTA抗凝静脉全血。
[0011]所述结合缓冲液成分包括Tris、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、氯化钾、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、巴比妥酸、巴比妥钠、甲酸、乙
酸、碳酸氢铵、氯化钙、乙腈、氢氧化钠、盐酸、EDTA、SDS、NP
‑
40、CHAPS、吐温、Triton、PEG的中的一种或任意组合，优选为Tris、EDTA的组合缓冲液。
[0012]优选的，步骤S1中，所述磁珠材料选自四氧化三铁，或其与聚苯乙烯、分子筛、二氧化硅中的一种或几种的复合物，例如四氧化三铁与聚苯乙烯形成的复合物磁性聚苯乙烯微球等。
[0013]优选的，步骤S1中，所述混合孵育条件为：孵育温度为4～37℃，孵育时间为1～120分钟，震荡速度为0～1000转/分钟。
[0014]优选的，步骤S2中，所述清洗缓冲液选自步骤S1所使用的结合缓冲液或相应稀释液；所述重悬清洗条件为为4～37℃，震荡速度为0～3000转/分钟，时间为1～30分钟。
[0015]优选的，步骤S2中，该步骤可重复多次，优选3次。
[0016]优选的，步骤S3中，所述蛋白质组样品的制备方法包括如下步骤:向所述磁珠中加入还原试剂和烷基化试剂，经还原烷基化反应后，向体系中加入测序级及以上的胰蛋白酶及消化缓冲液，进行酶解反应；酶解后样品经脱盐后，得到蛋白质组样品。
[0017]进一步优选的，
[0018]所述还原试剂为二硫苏糖醇或三(2
‑
羧乙基)膦；所述烷基化试剂为碘乙酰胺或氯乙酰胺；加入所述还原试剂后于45～95℃条件下反应0～60分钟，再加入烷基化试剂避光室温反应5～60分钟；
[0019]所述消化缓冲液包括氯化钙、碳酸氢铵等，pH值为7.0～8.8；所述胰蛋白酶的加入量为0.1～10ug/μL；所述酶解条件为：温度为25～37℃，时间为1～16小时；所述脱盐步骤为使用所述相同硅铝酸盐类、聚苯乙烯类、C18类等材料进行吸附、清洗及解吸附或加入终浓度>80％的乙腈、甲醇、乙醇等有机溶剂将肽段沉淀在磁珠表面并去除溶液中的盐类。
[0020]优选的，步骤S3中，所述质谱检测方法为：采用液相色谱
‑
串联质谱方法进行检测，使用软件对数据进行抽提后，获得蛋白及肽段定量定性数据。
[0021]有益效果：与现有技术相比，本专利技术利用磁珠和特定的缓冲体系，可以直接富集全血样本中的蛋白质，可以同时应用于新鲜或冷冻的全血样本。对于新鲜采集的样本，所采用的缓冲液体系可以在蛋白富集过程中有效保护血细胞不受破坏，从而避免血细胞破裂释放出干扰蛋白，蛋白鉴定数及定量值与血浆样本具有良好一致性。对于冷冻保存的全血标本，磁珠选择性吸附血液中的低丰度蛋白，可以同时有效去除样本中血浆和血细胞来源的高丰度蛋白，具有稳定的高蛋白鉴定数及更高的定量稳定性。本专利技术方法应用于全血蛋白组分析，可以简化样本前处理步骤，避免离心分离血浆过程中造成的蛋白损失，对于不能及时处理或不具备离心条件的全血样本可以直接冷冻保存后再检测。
附图说明
[0022]图1新鲜全血样本经本专利技术方法处理后离心分层图。
[0023]图2本专利技术方法处理全血样本后的蛋白凝胶电泳图：1为磁珠处理的冷冻全血蛋白，2为磁珠处理的新鲜全血蛋白，3为磁珠处理的血浆蛋白，4为未处理血浆对照。
[0024]图3本专利技术方法处理新鲜全血样本和血浆样本鉴定蛋白韦恩图。
[0025]图4本专利技术方法处理新鲜全血样本和血浆样本定量相关性。
[0026]图5本专利技术方法处理采集后0
‑
8小时内冷冻保存的添加不同抗凝剂的全血样本蛋
白定量相关性：1为EDTA抗凝全血，2为枸橼酸钠抗凝静脉全血。
[0027]图6本专利技术方法处理三例采集后8
‑
72小时内冷冻保存的全血样本蛋白定量相关性。
具体实施方式
[0028]以下对本专利技术方案进行全面的描述，所述的实施案例是本专利技术中最优选实施方式，但本专利技术并不限于以下实施例。
[0029]实施例1
[0030]1.取新鲜采集的抗凝静脉血，等分为两份；
[0031]2.其中一份轻微颠倒2～3次使样本混合均匀，得到全血样本；
[0032]3.将另一份于4℃离心机中，1300g离心10分钟，取上层血浆样本；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种全血蛋白质组学分析方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、向全血样本中加入结合缓冲液和磁珠，混合孵育后，经过磁分离收集磁珠；S2、向步骤S1所得磁珠中，加入清洗缓冲液，重悬清洗后，经过磁分离收集磁珠，重复该步骤数次；S3、将步骤S2所得磁珠制备成蛋白质组样品，进行质谱检测。2.根据权利要求1所述的全血蛋白质组学分析方法，其特征在于，步骤S1中，所述全血样本为新鲜采集、部分溶血或冷冻保存的抗凝全血样本。3.根据权利要求1所述的全血蛋白质组学分析方法，其特征在于，步骤S1中，所述结合缓冲液成分包括Tris、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、氯化钾、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、巴比妥酸、巴比妥钠、甲酸、乙酸、碳酸氢铵、氯化钙、乙腈、氢氧化钠、盐酸、EDTA、SDS、NP
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40、CHAPS、吐温、Triton、PEG中的一种或任意组合。4.根据权利要求1所述的全血蛋白质组学分析方法，其特征在于，步骤S1中，所述磁珠为具有磁性的材料，包括纳米四氧化三铁，或与聚苯...

【专利技术属性】
技术研发人员：李臻，宋雷，陈亮宇，赵娜，李捷，
申请(专利权)人：谱天天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：