本发明专利技术涉及一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法及应用。所述该检测方法由布病间接ELISA(iELISA)和竞争ELISA(cELISA)方法组成。采用布病阳性血清国家标准品(牛源，含量1000IU/mL)对布病iELISA和cELISA方法的检测灵敏度进行定量，使两种方法的检测灵敏度与布病补体结合试验(CFT)检测灵敏度一致，并最终以血清中牛布鲁氏菌病特异性抗体IgG和IgM含量不低于50IU/mL作为阳性临界值判定标准。该方法对同一份牛血清分别用布病iELISA和cELISA检测，可准确将待检牛分为布病阴性牛、布病可疑牛和布病阳性牛，为实施布病净化提供便捷有效的方法。便捷有效的方法。便捷有效的方法。
【技术实现步骤摘要】
一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法及应用
[0001]本专利技术涉及一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法及应用，属免疫检测
技术介绍
[0002]布鲁氏菌病(简称“布病”)是一种由布鲁氏菌引起的慢性多器官损伤性人畜共患传染病，WHO将布鲁氏菌病视为“世界范围内流行最广泛的人畜共患病，但也是最易被人们所忽视的7种重要传染病之一”。布病主要是通过直接或间接接触染病动物或动物产品而感染。人类患布病后，会引起发热、肌肉和关节疼痛等，严重者完全丧失劳动能力；家畜感染布病则引起流产和不育，给养殖业造成巨大的经济损失，严重威胁人类食品安全和公共卫生安全。
[0003]我国自2000年之后，不管是人间还是畜间的布病发生率均呈逐年上升趋势。布病防控面临主要难点在于不能精准剔除阳性动物，导致传染源在群体中的长期存在，布病净化难以实现。现有的布病诊断方法中，间接ELISA(iELISA)可检测血清中布鲁氏菌特异性IgG抗体，适用于布病的确诊；竞争ELISA(cELISA) 可同时检测血清中特异性IgM和IgG抗体，适用于布病的初筛。本专利技术利用上述两种方法检测抗体类型的差异，通过布病阳性血清国家标准品统一两种方法的检测灵敏度，建立一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量对布病非免疫牛实现准确判定的方法。
[0004]申请人已成功开发了牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试剂盒和布鲁氏菌竞争ELISA抗体检测试剂盒，均获得了国家三类新兽药证书((2015)新兽药证字 67号、(2016)新兽药证字6号)。以此为基础，通过布病阳性血清国家标准品 (牛源，含量1000IU/mL)对两种试剂盒进行检测灵敏度定量，使两种检测方法的检测灵敏度均为血清中布鲁氏菌特异性抗体含量不低于50IU/mL为阳性。同时其检测灵敏度与布病诊断金标准补体结合试验(CFT)的检测灵敏度保持一致，保证检测结果的准确性。对于同一份血清样品同时进行iELISA和cELISA 的检测，根据两者的检测结果最终判定阳性、可疑与阴性，从而便于精准剔除布病阳性牛，快速实现布病净化的目的。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于提供一种准确性高、操作简便的检测布病阳性牛的方法。
[0006]本专利技术的技术方案为：
[0007]1.一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于该方法由特定布病间接ELISA(iELISA)和竞争ELISA(cELISA)方法组成；采用布病阳性血清国家标准品对布病iELISA和cELISA方法的检测灵敏度进行定量，使两种方法的检测灵敏度与布病诊断金标准CFT方法的检测灵敏度一致，均以血清中布鲁氏菌特异性抗体IgG和IgM含量不低于50IU/mL为阳性临界值判定标准。
[0008]2.本专利技术所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于采
用布病阳性血清国家标准品对布病iELISA和cELISA方法的检测灵敏度进行定量。
[0009]3.本专利技术所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述布病阳性血清国家标准品制备与含量测定方法为：
[0010]用2mL布鲁氏菌疫苗株A19灭活抗原(4.0
×
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CFU/ml)颈部皮下免疫布病阴性的牛。初免3个月后进行加强免疫，以双倍剂量颈部皮下加强免疫1次。加强免疫后2周采血，用CFT试验测定其效价应不低于1000IU/mL。用布病阴性血清将阳性血清稀释至CFT效价为1000IU/mL，加入proclin300至终浓度为 0.05％，无菌分装，冻干后置
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20℃保存。
[0011]4.本专利技术所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述方法布病间接ELISA(iELISA)检测灵敏度为血清中布鲁氏菌特异性抗体IgG含量不低于50IU/mL为阳性。
[0012]5.本专利技术所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述布病间接ELISA(iELISA)检测灵敏度的定量方法为：
[0013]用纯化的布鲁氏菌LPS(浓度15μg/mL)作为抗原包被酶标板，每孔100μL。加入封闭液200μL，2～8℃封闭24小时。以洗涤液300μL/孔洗板1次。将用生理盐水将布病阳性血清国家标准品进行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等 5个不同稀释度备用，即血清抗体含量为200IU/mL、100IU/mL、50IU/mL、25 IU/mL、12.5IU/mL。各稀释度血清再用样品稀释液进行1∶50倍稀释，加入酶标板，每孔100μL，37℃作用30分钟。每孔加入300μL洗涤液，洗涤3次。将兔抗牛IgG抗体用抗体稀释液作1∶200稀释后，每孔加入100μL，37℃作用30 分钟。再次洗涤3次。加入底物显色液，室温避光显色15分钟后，每孔加50μL 终止液终止反应。在酶标仪下测定OD
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值，计算P％值，确定iELISA方法检测灵敏度结果：布病阳性血清国家标准品稀释1∶20(即50IU/mL)检测为阳性；布病阳性血清标准品稀释1∶40(即25IU/mL)检测为阴性。
[0014]6.本专利技术所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述方法布病竞争ELISA(cELISA)检测灵敏度为血清中布鲁氏菌特异性抗体IgG和IgM含量不低于50IU/mL为阳性。
[0015]7.本专利技术所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述布病竞争ELISA(cELISA)检测灵敏度的定量方法为：
[0016]用纯化的布鲁氏菌LPS(浓度15μg/mL)作为抗原包被酶标板，每孔100μL。加入封闭液200μL，2～8℃封闭24小时。以洗涤液300μL/孔洗板1次。将用生理盐水将布病阳性血清国家标准品进行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等 5个不同稀释度备用，即血清抗体含量为200IU/mL、100IU/mL、50IU/mL、25 IU/mL、12.5IU/mL。各稀释度血清再用样品稀释液进行1∶20倍稀释，加入酶标板，每孔50μL，同时加入已稀释好的单克隆抗体，每孔50μL，振荡5分钟。 37℃作用30分钟。每孔加入300μL洗涤液，洗涤3次。将羊抗鼠IgG抗体用抗体稀释液作1∶100稀释后，每孔加入100μL，37℃作用30分钟。再次洗涤3次。加入底物显色液，室温避光显色15分钟后，每孔加50μL终止液终止反应。在酶标仪下测定OD
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值，计算PI％值，确定cELISA方法检测灵敏度结果：布病阳性血清国家标准品稀释1∶20(即50IU/mL)检测为阳性；布病阳性血清标准品稀释1∶40(即25IU/mL)检测为阴性。
[0017]8.本专利技术所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法在布病非免疫牛群中的应用，其特征在于按照如下步骤进行：<本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于该方法由特定布病间接ELISA(iELISA)和竞争ELISA(cELISA)方法组成；采用布病阳性血清国家标准品(牛源，含量1000IU/mL)对布病iELISA和cELISA方法的检测灵敏度进行定量，使两种方法的检测灵敏度与布病CFT方法的检测灵敏度一致，均以血清中布鲁氏菌特异性抗体IgG和IgM含量不低于50IU/mL作为阳性临界值判定标准。2.如权利要求1所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于采用布病阳性血清国家标准品对布病iELISA和cELISA方法的检测灵敏度进行定量。3.如权利要求2所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述布病阳性血清国家标准品制备与含量测定方法为：用2mL布鲁氏菌疫苗株A19灭活抗原(4.0
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CFU/ml)颈部皮下免疫布病阴性的牛。初免3个月后进行加强免疫，以双倍剂量颈部皮下加强免疫1次，加强免疫后2周采血，用CFT试验测定其效价应不低于1000IU/mL，用布病阴性牛血清将阳性血清稀释至CFT效价为1000IU/mL，加入proclin 300至终浓度为0.05％，无菌分装，冻干后置
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20℃保存。4.如权利要求1和2所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述方法布病间接ELISA(iELISA)检测灵敏度为血清中布鲁氏菌特异性抗体IgG含量不低于50IU/mL为阳性。5.如权利要求4所述一种检测牛布鲁氏菌病特异性IgG和IgM含量的方法，其特征在于所述布病间接ELISA(iELISA)检测灵敏度的定量方法为：用纯化的布鲁氏菌LPS(浓度15μg/mL)作为抗原包被酶标板，每孔100μL。加入封闭液200μL，2～8℃封闭24小时；以洗涤液300μL/孔洗板1次。将用生理盐水将布病阳性血清国家标准品进行1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80等5个不同稀释度备用，即血清抗体含量为200IU/mL、100IU/mL、50IU/mL、25IU/mL、12.5IU/mL；各稀释度血清再用样品稀释液进行1∶50倍稀释，加入酶标板，每孔100μL，37℃作用30分钟；每孔加入300μL洗涤液，洗涤3次；将兔抗牛IgG抗体用抗体稀释液作1∶200稀释后，每孔加入100μL，37℃作用30分钟；再次洗涤3次，加入底物显色液，室温避光显色15分钟后，每孔加50μL终止液终止反应；在酶标仪下测定OD
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值，计算P％值，确定iELI...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋卉，丁家波，范学政，沈青春，张广智，鑫婷，李松励，秦彤，汤新明，梁瑞英，梁琳，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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