前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白（a）胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白（a）胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用。所述前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白（a）胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用包括以下步骤：1：设计并构建表达人PCSK9和Lp(a)蛋白的质粒，表达并纯化蛋白，注射小鼠腹腔得到对应抗体；2：纯化后的抗体，固定于反应垫，胶体金结合的抗体固定于结合垫。本发明专利技术提供的前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白（a）胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用具有减轻患者经济负担、快速区分冠脉粥样硬化高危人群，及时干预预防治疗后血栓形成，提高患者预后生活质量的优点。提高患者预后生活质量的优点。提高患者预后生活质量的优点。

【技术实现步骤摘要】
前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白(a)胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用


[0001]本专利技术涉及冠脉粥样硬化心脏病诊断
，尤其涉及一种前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白(a)胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用。

技术介绍

[0002]心血管疾病(Cardiovasculardisease，CVD)是全球公认的导致人群死亡的主要原因之一，也是人类社会经济发展的主要障碍。根据《中国心血管健康与疾病报告2019概要》指出，目前我国心血管疾病患病率仍处于持续上升阶段，其病死率仍居首位，占居民死亡构成比的40％以上，并且逐渐出现了“农村高于城镇”的趋势。并且随着经济的发展和社会生活水平质量的逐步提高，其发病率、死亡率都显著升高，甚至存在发病年龄提前等趋势，更需要引起社会的广泛重视。由于目前我国患心脑血管疾病人群趋于年轻化，给社会及家庭带来严重负担，因此早期诊断及正确的临床干预便显得十分重要。冠心病(coronary heart disease，CHD)作为CVD当中最为常见的一类疾病，其主要病理基础为动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)，是一种以内皮细胞活化、单核细胞聚集和血管平滑肌细胞(Vascularsmooth muscle cells，VSMCS)增殖为特征的动脉壁慢性炎症性疾病，而动脉粥样硬化斑块的形成或性质的改变，在冠心病的发生发展中起着核心作用。在此基础上易引发病变斑块不稳定，继而斑块破裂，血管痉挛并伴发血小板黏附、聚集和继发性血栓形成，导致急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome，ACS)的发生。目前临床上诊断CHD的“金标准”仍然是冠状动脉造影(coronary angiography，CAG)。但由于其为有创性检查，并且缺乏及时性，尤其不适用于我国医疗资源比较匮乏的农村及偏远地区。因此，寻找合适的血清标志物来快速评估冠脉狭窄和心肌缺血的严重程度，对于减少我国农村及落后偏远地区急性不良心血管事件的发生，改善患者预后等方面尤为重要。
[0003]既往研究表明，脂代谢紊乱尤其是低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol，LDL
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C)水平的升高是导致动脉粥样硬化斑块形成的基础，及时降解或清除沉积在血管壁上的LDL
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C能够显著降低斑块的不稳定性，从而减少急性心血管事件发生的风险。一项纳入了26个随机试验评估他汀类药物对胆固醇及主要心血管事件影响的前瞻性系统性分析指出，LDL
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C每降1mmol/L，可使心血管事件发生风险下降22％。美国脂质协会(National Lipid Association，NLA)也指出[8]，LDL
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C是唯一能独立导致动脉粥样硬化性心血管病(AtheroscleroticCardiovascular Disease，ASCVD)的脂蛋白，降低LDL
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C与降低ASCVD的风险呈正相关。低密度脂蛋白(Low
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densitylipoprotein，LDL)和极低密度脂蛋白(verylow
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densitylipoprotein，VLDL)的过度积累会激活血管内皮细胞并触发炎症性细胞因子的分泌，从而导致单核细胞募集并分化为巨噬细胞。积累的脂质和脂蛋白被巨噬细胞吞噬，并以脂质小滴(Lipiddroplets，LDs)形式存在于巨噬细胞中使其进一步转化为泡沫细胞。在此基础上进一步激活炎症反应和增加动脉粥样硬化斑块破裂的风险。随着对LDL
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C认识的深入，LDL
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C水平越低，冠心病风险越低的概念越来越受到研究学者与
临床医生的认可。在当前人类研发的所有能够调节LDL
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C水平的药物中，他汀类药物无疑是其中的佼佼者。大量涉及脂类代谢的临床结果表明，积极或强化的他汀治疗可明显改善CAD的预后、降低死亡率。然而，他汀类药物仍面临着诸多挑战，如他汀对LDL
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C降低存在局限性，即增大他汀类药物剂量所带来的LDL
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C水平下降并不呈现剂量效应关系，而似乎总是6％，这一现象被称为“6％规律”。再者，强化他汀治疗后出现的心血管“剩余风险”等现象仍有待进一步研究。综上所述，由于脂质代谢异常和ASCVD存在着千丝万缕的联系，而粥样斑块的改变，易引起的冠脉狭窄势必导致心肌缺血，所以某些参与血脂调控的标志物在诊断心肌缺血以及冠脉损伤等方面有独到的优势，对于减轻患者经济负担提升预后生活水平等方面具有重要意义。
[0004]前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin kexintype9，PCSK9)是近些年来新发现的一种与脂代谢调节密切相关的丝氨酸蛋白酶，它是前蛋白转化酶家族的第9个成员。人类PCSK9基因位于染色体1p32.3位点，共包含3617个碱基，编码692个氨基酸，主要包括4个结构域，分别为信号肽(1
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30)、前片段(31
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152)、催化结构域(153
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451)及羧基末端结构域(526
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692)。PCSK9在多个组织中均表达，尤其在肝脏、肾脏、小肠和胰腺中表达较为丰富。研究表明，PCSK9主要通过诱导低密度脂蛋白受体(LDL
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R)在溶酶体降解而减少LDL
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R对血浆LDL
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C的摄取。正常生理情况下，血浆中的LDL
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C被细胞表面的LDL
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R识别后转运至溶酶体内被降解，而LDL
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R则重新回到细胞表面继续循环利用，PCSK9则通过降解LDL
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R导致细胞对LDL
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C的清除减少。研究表明，PCSK9受多种转录因子的调控，其中固醇调节元件结合蛋白2(sterol regulatory element binding protein，SREBP2)是PCSK9最主要的转录激活因子。当细胞内胆固醇水平降低时，刺激SREBP裂解激活蛋白结构域构象发生改变而释放活化的SREBP2，从而使PCSK9的转录水平升高。他汀类降脂药物通过抑制细胞胆固醇的合成，促进了SREBP2的表达，因此他汀类药物通过上调LDL
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R的表达而降低LDL
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C在血浆中的含量，但同时也促进了PCSK9的分泌。这一现象明显减弱了他汀的降血脂效果，目前已有临床研究证实了这一观点。这可能是影响他汀类药物降脂效果的原因之一。研究还发现，PCSK9水平除与脂代谢异常相关外，PCSK9基因功能多态性与心血管疾病密切相关。PCSK9基因获得型(gain of
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function，GOF)突变可增加PCSK9上调LDL
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C的能力，增加了心脑血管事件的发生风险，目前已知的主要突变表现形式有R306S、D3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白（a）胶体金快速检测试剂盒在冠心病诊断中的应用，其特征在于，包括以下步骤：S1：设计并构建表达人PCSK9和Lp(a)蛋白的质粒，并用大肠杆菌Rosetta2菌株表达；S2：通过蛋白纯化的方法得到人PCSK9和Lp(a)蛋白，并进行脱盐冻干；S3：使用PBS将PCSK9和Lp(a)蛋白融解，加入等体积弗氏完全佐剂进行乳化；S4：用乳化好的蛋白溶液注射到小鼠腹腔，得到含有抗体的腹水；S5：收集腹水，使用蛋白G微珠层析柱进行抗体纯化，得到小鼠抗PCSK9抗体和小鼠抗Lp(a)抗体；S6：胶体金溶液的pH值调节至9.0，按照不出现聚集现象的原则选择抗体浓度，对抗体进行胶体金标记；S7：在反应垫上分别固定鼠抗人PCSK9抗体、鼠抗人Lp(a)抗体和羊抗鼠IgG抗体，在结合垫上加入胶体金标记鼠抗人PCSK9抗体和胶体金标记鼠抗人Lp(a)抗体；S8：通过调节反应垫上固定的抗体含量，和/或结合垫中金标抗Lp(a)抗体的含量，将Lp(a)蛋白的检出限调整为30 mg/dL。2.根据权利要求1所述的前蛋白转化酶枯草溶菌素9联合脂蛋白（a）胶体金快速检测试剂盒在冠心病...

【专利技术属性】
技术研发人员：管晨，黄大伟，费明明，黄锡通，叶如剑，杨合慧，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，
类型：发明
国别省市：