LILRB1在制备预测自然流产的检测产品中的应用制造技术

本发明专利技术公开了LILRB1(白细胞免疫球蛋白样受体B1)作为生物标记物在制备预测自然流产的检测产品中的应用。本发明专利技术经研究发现，自然流产患者存在LILRB1在外周血及蜕膜NK细胞表达比例的下降，并且外周血NK细胞LILRB1表达比例与蜕膜NK细胞LILRB1表达比例呈正相关。因此，可以将表达LILRB1的外周血NK细胞、表达LILRB1的蜕膜NK细胞作为生物标记物用于预测自然流产，预测孕妇的子宫局部与全身的免疫耐受状态，可及早识别自然流产，方便可靠。方便可靠。方便可靠。

【技术实现步骤摘要】
LILRB1在制备预测自然流产的检测产品中的应用


[0001]本专利技术涉及LILRB1作为生物标记物在制备预测自然流产的检测产品中的应用，属于生物


技术介绍

[0002]外周血HCG
‑
β和孕酮在妊娠维持和胚胎发育中发挥重要作用，是临床实践中用来预测妊娠结局的主要检测指标。通过动态监测外周血HCG
‑
β和孕酮水平可以及早预测自然流产的发生，但是越来越多的证据表明，外周血HCG
‑
β和孕酮作为自然流产的预测指标有很多缺陷，如发现外周血HCG
‑
β下降时，胚胎已无法挽救；部分孕妇胚胎已停止发育，却仍维持较高的HCG
‑
β水平和上升幅度；正常妊娠HCG
‑
β增长也可能异常；孕酮水平不能准确反映妊娠状态等。因此，临床实践中急需寻找一种能够准确反应妊娠早期孕妇的妊娠状态且方便可靠的指标。
[0003]相关研究表明，胚胎携带有父系来源的HLA抗原，对母体相当于同种半异体移植物。正常妊娠时，通过调节胚胎的抗原特性、体液免疫和细胞免疫等的平衡，母体对胚胎形成免疫耐受而不发生排斥反应；一旦平衡被破坏，免疫系统就会激活、排斥胚胎，进而引起自然流产等妊娠并发症。
[0004]自然流产严重危害育龄女性生殖健康，发生率约为15％，且呈逐年上升的趋势，反复的妊娠失败也会给患者及其家庭带来心理影响和经济压力。自然流产尤其是复发性流产病因复杂且多样，即使经过系统的病因学筛查，仍然有超过半数患者病因不明。母体免疫因素或胚胎因素是可能的专利技术原因之一，其中母胎免疫耐受的破坏被认为是关键因素之一。
[0005]母胎界面是母胎免疫耐受过程的核心部位，主要由滋养细胞、蜕膜基质细胞、蜕膜免疫细胞构成，其中蜕膜免疫细胞是母胎免疫耐受形成和维持的基础，它们通过表达特殊的细胞表面受体和分泌多种细胞因子，起重要的局部调节作用。既往研究表明，蜕膜NK细胞是妊娠早期母胎界面主要的淋巴细胞，占母胎界面免疫细胞比例高达70％，在母胎免疫耐受形成和维持、滋养细胞侵袭、母胎界面血流改变中发挥重要作用，其数量和功能异常将导致自然流产、子痫前期等妊娠并发症。但是蜕膜组织由于难以获取并不适合作为自然流产的预测指标，因此，临床实践中急需寻找一个简单便捷的方法来准确评估妊娠早期孕妇的免疫耐受状态，从而及早识别自然流产，进行干预。

技术实现思路

[0006]针对上述现有技术，本专利技术提供了一种预测自然流产的新型生物标记物——LILRB1(白细胞免疫球蛋白样受体B1)，该生物标记物可用于作为早期妊娠失败的预测指标。LILRB1是一种广泛表达在NK细胞、巨噬细胞等免疫细胞表面的免疫抑制性受体，在免疫稳态的维持中发挥着极其重要的作用。本专利技术经研究发现，自然流产患者存在LILRB1在外周血及蜕膜NK细胞表达比例的下降，并且外周血NK细胞LILRB1表达比例与蜕膜NK细胞LILRB1表达比例呈正相关。
[0007]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0008]LILRB1作为生物标记物，在制备预测自然流产的检测产品中的应用。
[0009]表达LILRB1的外周血NK细胞作为生物标记物，在制备预测自然流产的检测产品中的应用。
[0010]表达LILRB1的蜕膜NK细胞作为生物标记物，在制备预测自然流产的检测产品中的应用。
[0011]所述检测产品为检测试剂、检测试剂盒。
[0012]一种预测自然流产的检测产品，包括与LILRB1特异性结合的抗体。
[0013]一种预测自然流产的方法，包括以下步骤：
[0014](1)检测：取待检测者的清晨空腹静脉血1mL(使用EDTA抗凝管收集血样，静置于4℃冰箱，24小时内进行标本处理)，流式细胞术检测LILRB1在外周血NK细胞的表达比例(即表达LILRB1的NK细胞的数量与NK细胞的数量的比值)；
[0015]或：取待检测者的蜕膜组织，提取原代蜕膜免疫细胞，流式细胞术检测LILRB1在蜕膜NK细胞的表达比例。
[0016](2)比较：将待检测者的LILRB1在外周血NK细胞/蜕膜NK细胞的表达比例，与健康孕早期女性的LILRB1在外周血NK细胞/蜕膜NK细胞的表达比例进行比较，若待检测者的LILRB1在外周血NK细胞/蜕膜NK细胞的表达比例明显低于健康孕早期女性的LILRB1在外周血NK细胞/蜕膜NK细胞的表达比例(有显著差异)，则预测待检测者本次妊娠不正常，自然流产的可能性高；若待检测者的LILRB1在外周血NK细胞/蜕膜NK细胞的表达比例与健康孕早期女性的LILRB1在外周血NK细胞/蜕膜NK细胞的表达比例相当(无显著差异)，则预测待检测者本次妊娠正常。医生可将该检测结果、预测结果作为重要依据进行诊断、干预、治疗等。
[0017]所述健康孕早期女性的LILRB1在外周血NK细胞的表达比例，可以是实时检测的，也可以是存储在数据库中的(将以往的检测结果存储在数据库中)。
[0018]进一步地，比较的具体方式还可以为：将待检测者的LILRB1在外周血NK细胞/蜕膜NK细胞的表达比例，与数据库中的妊娠自然流产RSA患者的LILRB1在外周血NK细胞/蜕膜NK细胞的表达比例(将以往妊娠自然流产RSA患者的检测结果存储在数据库中)进行比较，若待检测者的LILRB1在外周血NK细胞/蜕膜NK细胞的表达比例与之相当(无显著差异)，则预测待检测者本次妊娠不正常，自然流产的可能性高；若待检测者的LILRB1在外周血NK细胞/蜕膜NK细胞的表达比例明显高于数据库中的妊娠自然流产RSA患者的LILRB1在外周血NK细胞/蜕膜NK细胞的表达比例(有显著差异)，则预测待检测者本次妊娠正常。
[0019]所述提取原代蜕膜免疫细胞的方法，包括以下步骤：
[0020](1)取待检测者的蜕膜组织(镊子及眼科剪尽量除去绒毛及血块)，镊子轻柔夹起置于生理盐水快速冲洗3遍，放入DMEM/F12(1：1)培养液，冰盒内保存及运输，2h内进行标本处理。
[0021](2)将蜕膜组织于PBS缓冲液充分洗涤，镊子及眼科剪再次仔细去除绒毛及血块，剪成约1mm3碎块(或剪碎至可用巴氏吸管吸出)，加入200U/L胶原酶、100U/L DNA酶和PBS缓冲液制成消化体系，置于空气摇床中消化15min。注意：需控制此步骤操作时间，蜕膜组织剪得越碎可获得的细胞越多，但时间越久细胞活性越弱。
[0022](3)消化终止后，将细胞悬液用巴氏吸管吸出，分别过100目、300目、400目筛网(事
先用PBS缓冲液润洗)，收集过目后所有液体，移至50ml离心管中，300g离心7min，弃上清液。
[0023](4)离心管底部细胞团于DMEM/F12(1:1)培养液重悬，重悬液小心铺于Percoll梯度液面上(自下至上依次为70％、50％、30％三种密度)，橡胶塞封住管口，2500r离心25min。
[0024](5)巴氏吸管吸取50％～70％密度梯度之间的细胞层，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.LILRB1作为生物标记物在制备预测自然流产的检测产品中的应用。2.表达LILRB1的外周血NK细胞作为生物标记物在制备预测自然流产的检测产品中的应用。3.表达LILRB1的蜕膜NK细胞作为生物标记物在制备预测自然流产的检测产品中的应用。4.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔宠，沈鸿飞，金大中，葛云鹏，李佳钋，侯悦，李媛媛，熊子越，张立阳，黄岭，李珍，宋双，张硕，
申请(专利权)人：中国医科大学附属盛京医院，
类型：发明
国别省市：