一种基于网络药理学筛选PGG抗胃癌关键靶点的方法技术

本发明专利技术公开一种基于网络药理学筛选PGG抗胃癌关键靶点的方法，并采用体内外实验探讨验证。包括以下步骤：采用网络药理学方法预测PGG可能通过PI3K

【技术实现步骤摘要】
一种基于网络药理学筛选PGG抗胃癌关键靶点的方法


[0001]本专利技术公开一种基于网络药理学的关键通路与关键靶点筛选方法，涉及细胞生物学领域，具体涉及一种生物信息学手段结合细胞生物学方法和体内外药效学探讨验证PGG在治疗胃癌中的应用潜力。

技术介绍

[0002]胃癌是一种异质性很强的疾病，是一个多因素参与、多步骤演变的复杂病理过程。国家和地区不同，胃癌的发生情况也不同，目前导致胃癌发生的主要因素包括环境、遗传、幽门螺旋杆菌、饮食、社会经济地位等。临床研究表明，联合治疗对非转移性胃癌和胃食管腺癌患者有效，围手术期化疗或术后化疗加放化疗被列为胃癌治疗指南中的首选方法。以上方法虽然可以抑制胃癌的发展但是会产生很大的毒副作用在一定程度上影响患者的健康，因此临床上一直寻找新的治疗方案。
[0003]1,2,3,4,6
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五没食子酰葡萄糖(PGG)，是一种来自于多种药用植物如五倍子、牡丹、芍药中的可水解多酚鞣酸单体化合物。文献报道PGG具有抗病毒、抗炎、抗糖尿病、抗癌等多种生理活性。PGG可抑制肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、乳腺癌等多种肿瘤细胞生长，被认为是潜在的抗肿瘤活性物质。Dong研究发现在HepG2、MCF
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7和A549细胞中，PGG可以通过激活自噬上游信号MAPK8/9/10引发细胞自噬促进细胞衰老发挥其抗癌活性然而其体内抗胃癌作用及分子机制仍不明确。
[0004]网络药理学是一种借助于数据库在分子水平上来预测药物作用机制的一种方法。网络药理学可以通过目标分子所延伸出的分子网络、网络靶点等信息揭示生物系统与药物之间复杂的关系为生物活性物质的发现、机理研究以及新药的研发等领域提供了新的思路。前期许多药物均通过网络药理学揭示了其内在关联。因此，现有技术中需要一种采用细胞实验并结合网络药理学方法探究1,2,3,4,6
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五没食子酰葡萄糖治疗胃癌的分子机制。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种筛选PGG抗胃癌作用关键通路与关键靶点的方法，通过网络药理学以及结合体内外实验验证PGG抗胃癌作用机制，将体外药效学的实验结果与网络药理学获得的关键靶点以及相关通路进行对应，确定其潜在的分子机制，为后续的开发应用提供参考。
[0006]本专利技术提供一种基于网络药理学筛选PGG抗胃癌关键靶点的方法，包括以下步骤，且以下步骤顺次进行，
[0007]S1、胃癌及PGG靶点的预测：
[0008]在Genecard、OMIM和DisGeNET三个疾病数据库以“Gastric Cancer”为关键词筛选得到胃癌相关靶点。以“Pentagalloylglucose”为关键词在SwissTargetPrediction和PharmMapper数据库中筛选得到PGG相关靶点；两者交集得到PGG抗胃癌的潜在治疗靶点。
[0009]S2、PGG抗胃癌靶点网络构建及Hub基因的筛选：
[0010]将交集靶点输入到STRING数据库选择物种为“Homo sapiens”，最低关系分数设置为0.4，除去游离的蛋白得到蛋白互作图，将其导入Cytoscape3.7.1中利用Cytohubba插件中的MCC计算方法筛选出排名前20的靶基因；
[0011]S3、Hub基因的验证：
[0012]关键靶基因使用PDB数据库获取对应蛋白的三级结构保存为pdb格式，Chem3D软件将PGG二维结构转换成三维结构保存为mol2格式，使用Autodock vina将Hub蛋白与PGG进行分子对接；Kaplan
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Meier生存曲线分析Hub基因对胃癌患者的预后价值，黑色折线代表基因在胃癌中低表达，红色折线代表基因在胃癌中高表达；
[0013]S4、GO、KEGG分析：
[0014]将Hub基因输入到DAVID数据库中得到GO和KEGG结果，得到的结果使用Rstudio进行绘图。
[0015]S5、胃癌体外模型的构建：
[0016]取小鼠胃癌(MFC)细胞，37℃、5％ CO2的培养箱中培养。培养基为补加10％灭活胎牛血清、100U/mL青霉素以及10mg/L链霉素；细胞贴壁后吸出培养基，用PBS清洗两次，继续培养；当细胞生长至80％
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90％用胰蛋白酶进行消化，传代，每1～2天传代一次；取对数生长期细胞备用；
[0017]S6、PGG抑制胃癌细胞的增殖、周期、线粒体膜电位、活性氧含量及凋亡：
[0018]将标品PGG配制成不同浓度分别对胃癌细胞进行处理，进行细胞增殖实验、细胞周期检测、细胞凋亡检测、线粒体膜电位检测以及细胞内活性氧浓度检测；
[0019]S7、胃癌体内模型的构建：
[0020]体内实验：在湖北省疾病预防控制中心实验动物中心获取雌雄各半共40只6周龄的SPF级Balb/c小鼠(18
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2g)在23℃室温条件下饲养于武汉轻工大学动物中心，光照循环，自由获取水与食物，实验前正常饲养一周适应环境；将生长状态良好的对数生长期细胞，调整细胞浓度至1
×
107cells/mL，取0.2mL的细胞悬液注射于小鼠腋下建立小鼠模型；
[0021]S8、PGG诱导小鼠体内胃癌的凋亡及抑制相关信号通路：
[0022]4天后随机将小鼠分成5组每组8只，实验组分别使用15mg/kg和30mg/kg的PGG、20mg/kg的5
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FU和PBS按照两天一次的频率进行腹腔注射，隔天记录小鼠体重与肿瘤大小，饲养至第14天使用乙醚对小鼠进行麻醉，取血处死；收集小鼠肝、脾、肾与肿瘤分别置于4％的甲醛固定液与
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80℃的冰箱中；所有实验流程均按照美国国立卫生研究院的《实验室动物护理和使用指南》，并经武汉轻工大学伦理委员会批准；对脏器进行HE切片染色，初步观察PGG体内毒性；对小鼠肿瘤组织进行Tunel染色观察PGG体内诱导肿瘤凋亡情况；在通路验证方面分为两个层次—基因层面进行实时荧光定量PCR，蛋白层面则采用蛋白质印迹法
[0023]步骤S4基因通路的验证主要是经过GO和KEGG富集分析所得到的PI3K
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AKT、MAPK信号通路。
[0024]步骤S6人源胃癌(HepG2)细胞进行增殖实验为，将标品PGG分别溶于少量的二甲亚枫之中，用培养基稀释成0μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM，对照组加入相同浓度、体积的五氟尿嘧啶；将对数生长的鼠源胃癌(MFC)细胞接种于96孔板，每组五个复孔；培养24小时后将孔内培养基吸出，PBS清洗两次，加等量不同浓度(0μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM)的PGG以及五氟尿嘧啶(阳性对照组)孵育24以及48小时，到时间后甩出孔板的含药
培养基，PBS清洗后每孔加入10μL的CCK
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8溶液放置培养箱中孵育三本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于网络药理学筛选PGG抗胃癌关键靶点的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、胃癌及PGG靶点的预测：在Genecard、OMIM和DisGeNET三个疾病数据库以“Gastric Cancer”为关键词筛选得到胃癌相关靶点；以“Pentagalloylglucose”为关键词在SwissTargetPrediction和PharmMapper数据库中筛选得到PGG相关靶点；两者交集得到PGG抗胃癌的潜在治疗靶点；S2、PGG抗胃癌靶点网络构建及Hub基因的筛选：将交集靶点输入到STRING数据库选择物种为“Homo sapiens”，最低关系分数设置为0.4，除去游离的蛋白得到蛋白互作图，将其导入Cytoscape3.7.1中利用Cytohubba插件中的MCC计算方法筛选出排名前20的靶基因；S3、Hub基因的验证：关键靶基因使用PDB数据库获取对应蛋白的三级结构保存为pdb格式，Chem3D软件将PGG二维结构转换成三维结构保存为mol2格式，使用Autodock vina将Hub蛋白与PGG进行分子对接；Kaplan
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Meier生存曲线分析Hub基因对胃癌患者的预后价值，黑色折线代表基因在胃癌中低表达，红色折线代表基因在胃癌中高表达；S4、GO、KEGG分析：将Hub基因输入到DAVID数据库中得到GO和KEGG结果，得到的结果使用Rstudio进行绘图；S5、胃癌体外模型的构建：取鼠源胃癌(MFC)细胞，37℃、5％CO2的培养箱中培养；培养基为补加10％灭活胎牛血清、100U/mL青霉素以及10mg/L链霉素；细胞贴壁后吸出培养基，用PBS清洗两次，继续培养；当细胞生长至80％
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90％用胰蛋白酶进行消化，传代，每1～2天传代一次；取对数生长期细胞备用；S6、PGG抑制胃癌细胞的增殖、周期、线粒体膜电位、活性氧含量及凋亡：将标品PGG配制成不同浓度分别对小鼠胃癌细胞进行处理，进行细胞增殖实验、细胞周期检测、细胞凋亡检测、线粒体膜电位检测以及细胞内活性氧检测；S7、胃癌体内模型的构建：取雌雄各半共40只6周龄的SPF级Balb/c小鼠在23℃室温条件下饲养于武汉轻工大学动物中心，光照循环，自由获取水与食物，实验前正常饲养一周适应环境；将生长状态良好的对数生长期细胞，调整细胞浓度至1
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107cells/mL，取0.2mL的细胞悬液注射于小鼠腋下建立小鼠模型；S8、PGG诱导小鼠体内胃癌的凋亡及抑制相关信号通路：4天后随机将小鼠分成5组每组8只，实验组分别使用15mg/kg和30mg/kg的PGG、20mg/kg的5
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FU和PBS按照两天一次的频率进行腹腔注射，隔天记录小鼠体重与肿瘤大小，饲养至第14天使用乙醚对小鼠进行麻醉，取血处死；收集小鼠肝、脾、肾与肿瘤分别置于4％的甲醛固定液与
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80℃的冰箱中；对脏器进行HE切片染色，初步观察PGG体内毒性；对小鼠肿瘤组织进行Tunel染色观察PGG体内诱导肿瘤凋亡情况；在通路验证方面分为两个层次—基因层面进行实时荧光定量PCR，蛋白层面则采用蛋白质印迹法。2.根据权利要求1所述的一种基于网络药理学筛选PGG抗胃癌关键靶点的方法，其特征在于，所述S4基因通路的验证主要是经过GO和KEGG富集分析所得到的PI3K
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AKT、MAPK信号
通路。3.根据权利要求1所述的一种基于网络药理学筛选PGG抗胃癌关键靶点的方法，其特征在于，步骤S6鼠源胃癌MFC细胞进行增殖实验为，将标品PGG分别溶于少量的二甲亚枫之中，用培养基稀释成0μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM，对照组加入相同浓度、体积的五氟尿嘧啶；将S5对数生长的鼠源胃癌MFC细胞接种于96孔板，每组五个复孔；培养24小时后将孔内培养基吸出，PBS清洗两次，加等量0μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM的PGG以及阳性对照组五氟尿嘧啶孵育24小时以及48小时，到时间后甩出孔板的含药培养基，PBS清洗后每孔加入10μL的CCK
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8溶液放置培养箱中孵育三个小时，将孔板置于酶标仪读取450nm处的吸光度，根据吸光度计算细胞增殖抑制率。4.根据权利要求1所述的一种基于网络药理学筛选PGG抗胃癌关键靶点的方法，其特征在于，梯度浓度的PGG孵育小鼠胃癌MFC细胞48h，同时设立阴性对照组，并收集细胞；PBS洗涤六孔板中的胃癌MFC细胞2次，胰酶消化1500rpm/min，5min离心收集孔板中细胞，调整细胞浓度至1
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106cells/mL，取1mL细胞悬液离心除去上清后，加入500μL的70％预冷乙醇固定细胞2h至过夜，染色前使用PBS清洗细胞，把100μL RNase A溶液加入至清洗好的细胞沉淀中重悬细胞，37℃水浴30min，加入400μL PI染色液混匀，4℃避光孵育30min，流式细胞仪检测。5.根据权利要求1所述的一种基于网络药理学筛选PGG抗胃癌关键靶点的方法，其特征在于，步骤S6鼠源胃癌MFC细胞进行细胞凋亡实验为，梯度浓度的PGG孵育小鼠胃癌MFC细胞48h，同时设立阴性对照组；2
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【专利技术属性】
技术研发人员：王丽梅，毕经会，王宏勋，易阳，闵婷，蒋玉菡，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：