本发明专利技术公开了巩板成骨/软骨间质前体细胞特征性表面分子标记、其筛选方法及应用，属于生物技术领域，解决现有技术中不能对体外分化制备所获的巩板成骨/软骨间质前体细胞进行分离、富集，影响临床安全性的问题。本发明专利技术的特征性表面分子标记包括ITGA9，该特征性表面分子标记在分离、富集人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞中的应用。本发明专利技术的ITGA9能够很好地区分分化得到的混合物中的目标细胞与非目标细胞；同时，分选得到的ITGA9阳性细胞中表达巩板间质前体细胞相关分子标记，具有成软骨及骨向分化的潜能，而阴性细胞不具备这样的能力。样的能力。样的能力。
【技术实现步骤摘要】
巩板成骨/软骨间质前体细胞特征性表面分子标记、其筛选方法及应用
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞特征性表面分子标记、其筛选方法及应用。
技术介绍
[0002]从体细胞诱导生成多能干细胞(iPSCs)是生物和医学领域的革命性发现。诱导多能干细胞具有多向分化潜能，且能实现自我更新。以多能干细胞为起点，通过重组蛋白、生长因子、小分子诱导等技术手段，已经实现了多种人体功能细胞的体外分化与规模化制备，包括心肌细胞、胰岛素分泌细胞、神经元等，是再生医学研究中具有重要转化价值的研究领域。
[0003]当前，利用多能干细胞制备功能细胞用于细胞治疗仍然面临一些关键技术/工艺问题亟需解决：以巩板来源的间质前体细胞为例，首先，其制备须历经多个胚层/多个分化步骤的诱导，即使在化学成分明确的培养基环境下，仍然存在一定的异质性。体外分化制备所获的细胞中，存在潜在的未分化iPSC，会给细胞制品带来潜在的成瘤风险，影响其临床转化的安全性。在细胞制备工艺中，须考虑对靶标细胞的特异性纯化富集以及对潜在的污染性iPSCs进行去除。这些技术工艺皆依赖于针对该靶标细胞的特异性表面标记物的鉴定。其次，当前巩板间质前体细胞的制备过程仍然依赖于报告基因的表达，即利用Sox9报告基因敲入的iPSC进行体外诱导分化，此制备工艺无法直接用于临床级细胞治疗药品的研发，而亟需开发不依赖于报告基因的细胞诱导分化与制备方法。因此，发掘可以有效富集巩板间质前体细胞的表面标志物是当前该细胞制备工艺上亟需解决的关键技术瓶颈。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的之一在于，提供人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞特征性表面分子标记，解决现有技术中不能对体外分化制备所获的巩板成骨/软骨间质前体细胞进行分离、富集，影响临床安全性的问题。
[0005]本专利技术的目的之二在于，提供人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞特征性表面分子标记的筛选方法。
[0006]本专利技术的目的之三在于，提供该表面分子标记的应用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]本专利技术提供的人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞特征性表面分子标记，其特征在于，包括ITGA9。
[0009]本专利技术提供的人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞特征性表面分子标记的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0010]步骤1.将人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞分选得到的SOX9阳性细胞作为阳性细胞，将SOX9阴性细胞作为阴性细胞，进行差异基因分析，将阳性细胞中相对
于阴性细胞表达上调至少两倍(Fold Change的对数值大于等于1)的基因作为差异基因；
[0011]步骤2.将差异基因与已知的表面分子蛋白进行比对后取交集，得到阳性细胞中所有表达上调的表面分子标记；
[0012]步骤3.计算所述表达上调的表面分子标记在阳性细胞及阴性细胞中的标准化表达量(TPM值)，删去阳性细胞中表达低和阴性细胞中表达高的表面分子标记，得到候选表面分子标记；
[0013]步骤4.根据基因标准化表达量，选定一个最优标记作为人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞特征性表面分子标记。
[0014]本专利技术的部分实施方案中，所述最优标记为ITGA9。
[0015]本专利技术的部分实施方案中，所述步骤1中，利用R语言平台的edgeR操作包进行差异基因分析。
[0016]本专利技术的部分实施方案中，所述步骤2中，利用R Studio软件，与已知的表面分子蛋白进行比对后取交集。
[0017]本专利技术的一个实施例中，步骤2中参考Damaris Bausc
‑
Fluck等利用质谱法对41种人源细胞及31种鼠源细胞建立的细胞表面蛋白分子库http://wlab.ethz.ch/cspa进行比对后取交集。
[0018]本专利技术的部分实施方案中，所述步骤3中，利用R Studio软件，计算所述表达上调的表面分子标记在阳性细胞及阴性细胞中的标准化表达量。
[0019]本专利技术的部分实施方案中，所述步骤3中，删去阳性细胞中标准化表达量小于50和阴性细胞中标准化表达量大于50的表面分子标记，得到候选表面分子标记。
[0020]本专利技术的部分实施方案中，还包括验证步骤，并根据验证结果，确定人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞特征性表面分子标记。
[0021]本专利技术的部分实施方案中，所述验证步骤包括：
[0022]S1.利用ITGA9抗体对巩板成骨/软骨间质前体细胞进行染色标记与分选；
[0023]S2.收集分选得到的ITGA9阳性细胞与ITGA9阴性细胞；
[0024]S3.将ITGA9阳性细胞与ITGA9阴性细胞进行体外成软骨诱导分化、成骨诱导分化；
[0025]S4.根据诱导分化后的ITGA9阳性细胞是否具有促进或/和修复软骨生长，促进或/和修复成骨作用，期定是否作为人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞特征性表面分子标记。
[0026]本专利技术提供的人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞特征性表面分子标记在分离、富集人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞中的应用。
[0027]本专利技术所述的人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞是指由人多能干细胞经诱导分化成的巩板成骨/软骨间质前体细胞。
[0028]人多能干细胞诱导为巩板成骨/软骨间质前体细胞的方法为现有技术。
[0029]或参照以下步骤进行：
[0030]步骤A.原条分化：将经接种传代后的人多能干细胞加入到分化培养基I中，诱导培养；所述分化培养基I为含有activin A、CHIR99021、bFGF的CDMi基础培养基；
[0031]步骤B.前体节中胚层分化：将经步骤A培养后的细胞吸去分化培养基I，涮洗细胞后，加入分化培养基II，诱导培养；所述分化培养基II为含有SB431542、LDN193189、
CHIR99021、bFGF的CDMi基础培养基；
[0032]步骤C.体节分化：将经步骤B培养后的细胞吸去分化培养基II，涮洗细胞后，加入分化培养基III，诱导培养；所述分化培养基III为含有PD0325901、XAV939的CDMi基础培养基；
[0033]步骤D.巩板间质干细胞分化：将经步骤C培养后的细胞吸去分化培养基III，涮洗细胞后，加入分化培养基IV，诱导培养；所述分化培养基IV为含有SAG、LDN193189的CDMi基础培养基.
[0034]步骤A中的诱导培养条件为37
±
1℃培养12
‑
48小时；优选为24小时；
[0035]或/和步骤B中的诱导培养条件为37
±
1℃培养12
‑
48小时；优选为24小时；
[0036]或/和步本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞特征性表面分子标记，其特征在于，包括ITGA9。2.根据权利要求1所述的人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞特征性表面分子标记的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.将人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞中分选得到的SOX9阳性细胞作为阳性细胞，SOX9阴性细胞作为阴性细胞，进行差异基因分析，将阳性细胞中相对于阴性细胞表达上调至少两倍的基因作为差异基因；步骤2.将差异基因与已知表面分子进行比对后取交集，得到阳性细胞中所有表达上调的表面分子标记；步骤3.计算所述表达上调的表面分子标记在阳性细胞及阴性细胞中的标准化表达量，删去阳性细胞中表达低和阴性细胞中表达高的表面分子标记，得到候选表面分子标记；步骤4.根据基因标准化表达量，选定一个最优标记作为人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞特征性表面分子标记。3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述最优标记为ITGA9。4.根据权利要求2或3所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1中，利用R语言平台的edgeR操作包进行差异基因分析。5.根据权利要求2或3所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤2中，利用R Studio软件，与已知的表面分子蛋白进行比对后取交集...
【专利技术属性】
技术研发人员：李中瀚，熊靖飞，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：
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