一种用于检测卡那霉素的多色可视化生物传感方法及其应用技术

一种用于检测卡那霉素的多色可视化生物传感方法及其应用，利用目标分析物卡那霉素与其核酸适配体的特异性识别来引发基于链置换反应形成的核酸循环I，进而触发基于双核酸酶催化反应的核酸循环II，同时释放出一个DNA单链；该链将触发两个含有回文碱基序列的发夹DNA的杂交链反应，实现一个超支化DNA纳米结构的放大组装和碱性磷酸酶的高含量捕获；基于碱性磷酸酶诱导金纳米锥上的银沉积引起其局域表面等离子体共振变化，构建金纳米锥的特征吸收峰波长变化值与卡那霉素浓度之间的定量关系；本方法灵敏度高，重复性和稳定性好，可同时用于卡那霉素残留的准确检测和半定量筛查，具有很好的应用价值。有很好的应用价值。有很好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测卡那霉素的多色可视化生物传感方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物分析
，具体是一种用于检测卡那霉素的多色可视化生物传感方法及其应用。

技术介绍

[0002]近年来，抗生素在畜牧业、医疗等相关领域中的不恰当使用引起的抗生素严重残留污染问题给社会公共健康带来了巨大威胁。由于抗生素的频繁使用和不间断排放，抗生素可以通过不同的途径进入水和土地环境，一方面进一步通过食物链富集进入人体、扰乱人体正常代谢，改变人体微生物群落，直接威胁人体安全。另一方面，抗生素抗性基因还会引起新型耐药菌的出现，对生态健康造成长期危害。例如，卡那霉素是由卡那霉素链霉菌生产的一种碱性氨基糖苷类抗生素，具有阻断蛋白质合成的能力，可以用于治疗革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌和部分耐药金葡菌所引起的泌尿道、肠道、呼吸道严重感染感染，如鸡白痢、禽霍乱、伤寒、畜禽大肠杆菌病等，对鸡慢性呼吸道病、猪喘气病及萎缩性鼻炎等也有一定效果。然而，和其他氨基糖苷类抗生素相同，卡那霉素的安全使用限度相对较窄，长期、过量使用会引起人体发生过敏、免疫病理作用、肾病、肝毒性、致突变性、致癌性、骨髓毒性、生殖障碍，甚至过敏性休克等多种毒性反应。因此，包括我国在内的许多国家和地区都对食物和环境介质中的卡那霉素等抗生素残留最大限量提出了严格的限值标准。
[0003]为了满足抗生素残留物定量检测的迫切需要，在过去的几十年中，广大科研工作者开发了许多针对抗生素检测的方法，其中以高效液相色谱法等分离分析方法应用最为广泛。但是，这些方法通常前处理操作繁琐，对检测人员技术要求高，设备昂贵，而且一般只能在实验室中进行。与之相比，利用抗体、核酸适配体等作为识别元件与目标分析物进行特异性结合，并将其与适当的信号转换方式相结合而发展起来的生物传感器由于具有操作简单、分析成本低、样品消耗量小、易于集成化等优点，非常有利于用于环境检测、食品工业、临床医学等领域中抗生素残留的现场检测。
[0004]此外，与其它光电分析方法相比，比色生物传感器还可以直接通过裸眼观察颜色变化来进行目标分析物的快速直接半定量筛查，因而受到人们广泛关注。然而值得注意的是，当前的许多比色生物传感方法的信号转导都是建立在各种酶或模拟酶的催化显色反应的基础上。一方面，其有色催化产物通常稳定性较差；另一方面，这些方法的比色信号读出通常仅依赖于单种颜色的吸收强度变化，严重限制了可视化检测的准确度和灵敏度。相比之下，各种金纳米材料由于具有合成简单、稳定性好、具有吸光系数强且易于调控的局域表面等离子体共振吸收性质，使得人们可以方便在此基础上构建一类基于颜色变化和波长分辨的比色信号转导新方法。但是，目前通常利用金纳米粒子的盐诱导聚集作用引起其颜色变化来构建此类生物传感方法，它们不仅灵敏度较低，而且非常易于受到离子强度等样品基质效应的干扰。为此，发展一种具有操作简单、灵敏度和选择性高，且具有较低分析成本等优良性能的多色可视化抗生素生物传感新方法对于实现食品或水体等复杂介质中抗生素残留的现场快速筛查具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的就是针对目前卡那霉素等抗生素的传统检测方法存在操作繁琐、分析效率低、分析成本较高、不能进行现场检测等问题，而基于酶或模拟酶催化底物显色反应，以及金纳米粒子盐诱导聚集所构建的比色生物传感方法存在灵敏度、准确性和稳定性不高等挑战，提供一种用于检测卡那霉素的多色可视化生物传感方法，该方法构建了多色的新型金纳米锥沉积银体系，并将该体系应用于卡那霉素等抗生素的检测中，具有操作简单、灵敏度高、线性范围宽、选择性和重复性好、检测成本低廉等优点，可以广泛地应用于食品或水体等复杂基质中的抗生素残留现场快速筛查和准确检测。
[0006]为实现上述专利技术目的，本专利技术是通过以下技术方案来实现的：
[0007]本专利技术提供的一种用于检测卡那霉素的多色可视化生物传感方法，包括以下步骤：
[0008](1)DNA链的预处理
[0009]取6个PV管并分别编号为#1、#2、#3、#4、#5、#6，向#1PV管中加入190μL浓度为10mM pH＝7.4的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液，向#2、#3PV管中加入90μL浓度为10mM pH＝7.4的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液，所述三(羟甲基)氨基甲烷缓冲溶液中含有100mM NaCl、10mM KCl、10mM MgCl2；
[0010]向#1PV管中加入10μL浓度为20μM发夹探针H1；所述发夹探针H1的碱基序列为5
’‑
TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA TAA GTA TAA GAT AGC CTC AAA GTT CAG CA
‑3’
；
[0011]向#2PV管中加入10μL浓度为20μM的发夹探针H2，所述发夹探针H2的碱基序列为5
’‑
CCA GGC CAA AGT TCA GTT GGA TGG AGC AGG TAT CAA CAT CAG CAG AGA CCC AGT ATT GCT GAA CTT TGA GGC TAA
‑3’
；
[0012]向#3PV管中加入10μL浓度为20μM的发夹探针H3，所述发夹探针H3的碱基序列为5
’‑
TTG CTG AAC TTT GTC ATA TTA GCC TCA AAG TTC AGC AAT ACT GG
‑3’
；
[0013]向#4PV管中加入25μL浓度为4μM的发夹探针H4，所述发夹探针H4的碱基序列为5
’‑
GGA TGG AGC AGG TAT CAA CAT CAG TCT GAT GGT AGG ATC AGA CTG ATG TTG ATA CCT GCT TTT GAT CGA TC
‑
biotin
‑3’
；
[0014]向#5PV管中加入25μL浓度为4μM的发夹探针H5，所述发夹探针H5的碱基序列为5
’‑
biotin
–
CCG TAC GGT TTA TCA GAC TGA TGT TGA TAC CTG CTC CAT CCA GCA GGT ATC AAC ATC AGT CTG ATC CTA CC
‑3’
；
[0015]向#6PV管中加入50μL浓度为20μM的捕获探针SC，所述发夹探针SC的碱基序列为5
’‑
TTT TTT TTT TTT TCC AGG CCA AAG TTC AG
‑3’
；
[0016]将#1、#2、#3、#4、#5PV管中的溶液均加热至95℃，保持5min后缓慢降温2h至室温，分别得到稳定的发夹茎环结构H1、H2、H3、H4、H5溶液；再将#6PV管中的溶液加热至95℃，保持5min后迅速冷却至室温，得到稳定的单链结构SC溶液；
[0017](2)功能化磁珠的制备
[0018]取1支本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
ng/mL、1
×
10
‑
4 ng/mL、1
×
10
‑
3 ng/mL、0.01 ng/mL、0.1 ng/mL和1 ng/mL的10 mM pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液于37 ℃条件下涡旋反应1 h；再向每支PV管中加入8 μL浓度为1 U/μL的phi29聚合酶溶液、5 μL 浓度为10 mM的dNTP、10 μL浓度为1 U/μL的Nt.BsmAI内切酶溶液、10 μL phi29聚合酶缓冲液和10 μL rCutSmart缓冲液，于37 ℃条件下涡旋反应2 h；最后将每支PV管中的溶液加热到65 ℃保持20 min，使phi29聚合酶和Nt.BsmAI内切酶失活；（4）超支化DNA纳米结构组装与标准溶液中卡那霉素含量的测定向步骤（3）中的每支PV管中加入50 μL MB/SC复合物、经步骤（1）退火处理后的25 μL浓度为4 μM发夹探针H4溶液、25 μL浓度为4 μM发夹探针H5溶液以及10 μL浓度为100 ng/μL的碱性磷酸酶标记链霉亲和素溶液，于37 o
C条件下涡旋反应80 min后，所得产物经磁分离并用1...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖国松，宇文新月，
申请(专利权)人：湖北师范大学，
类型：发明
国别省市：