一种基于人源间充质干细胞的脱细胞基质材料及其制备方法技术

本发明专利技术属于再生医学及组织工程技术领域，涉及一种基于人源间充质干细胞的脱细胞基质材料及其制备方法，包括：向贴壁生长的人源间充质干细胞中加入含有抗坏血酸的成膜培养基与不含有抗坏血酸的扩增培养基进行交替更换培养，形成细胞膜片；将细胞膜片与皿壁剥离开，得到所述细胞膜片；将制备得到的细胞膜片进行脱细胞化处理，得到所述脱细胞基质材料。制备所得到的细胞膜片脱细胞化后任然可以保持膜片状态有效，且所得到的脱细胞基质材料中的DNA成分得到有效除去，充分保留了细胞外基质的核心成分及相关成分、三维结构、无内毒素、无有机溶剂和有毒溶剂残留。有机溶剂和有毒溶剂残留。有机溶剂和有毒溶剂残留。

【技术实现步骤摘要】
一种基于人源间充质干细胞的脱细胞基质材料及其制备方法


[0001]本专利技术属于再生医学及组织工程
，涉及一种基于人源间充质干细胞的脱细胞基质材料及其制备方法。

技术介绍

[0002]传统上，ECM产品多采用同种异体或者异种组织制备而成，国内外已有来源于猪、马、牛等动物和人尸来源的真皮、心包、小肠等组织的脱细胞ECM材料产品进入临床应用。根据不同来源组织生物活性成分的差异，将分为两类惰性组织源材料和细胞外基质源材料。惰性组织源材料仅保留来源组织三维超微结构，组成成分中无生物活性成分，含有大量降解缓慢的弹性纤维，人体不易吸收，可导致修复区远期变形，易形成收缩性瘢痕化修复区域。
[0003]细胞外基质源材料以猪小肠黏膜下层(SIS)为代表。这种材料保留了多种生物活性成分，产品植入机体后可以主动诱导和促进周围细胞的迁入、黏附、增殖和分化，迁入的细胞对材料进行改造、降解和塑形，实现组织的形成和结构重塑。对已上市的异种脱细胞基质材料的临床试验结果分析表明，现有的产品均不同程度存在浆液肿、感染、免疫排斥反应、组织愈合不良等并发症。低免疫原性和无病毒传染风险是脱细胞ECM产品的基本要求。
[0004]与动物源或人尸源脱细胞ECM的脱细胞化过程比较，细胞源性脱细胞ECM过程简单，容易，更有利于排除不良反应，较好的保留ECM应有的活性。并且细胞培养过程更容易标准化，质量可控可溯。细胞膜片生成是细胞衍生细胞外基质的前提，目前较常用的细胞膜片制备方法主要是温敏法和机械分离法，虽然取得了一些成效，但细胞膜片的制备相对来说还是复杂，需要包被，需要特殊的温敏材料PIPA
‑
Am，批量获取困难。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于提供一种基于人源间充质干细胞的脱细胞基质材料及其制备方法。
[0006]一方面，本专利技术提供了一种制备人源间充质干细胞膜片的方法，包括如下步骤：
[0007]向贴壁生长的人源间充质干细胞中加入含有抗坏血酸的成膜培养基与不含有抗坏血酸的扩增培养基进行交替更换培养，形成细胞膜片；将细胞膜片与皿壁剥离开，得到所述细胞膜片。
[0008]相较于现有制备细胞膜片的方法，本专利技术所提供的上述制备人源间充质干细胞膜片的方法，通过将所述含有抗坏血酸的成膜培养基与不含有抗坏血酸的扩增培养基对贴壁生长的人源间充质干细胞进行交替更换培养，使得培养形成的细胞膜片的膜片完整性好、薄厚均匀、质地均匀，且不需要包被，也不需要特殊的温敏材料，且节约成本。
[0009]在一些实施方案中，包括如下步骤：
[0010]S1：选取融合度达60％
‑
90％、传代数为4
‑
10代的人源间充质干细胞；
[0011]S2：向贴壁生长的人源间充质干细胞中加入成膜培养基进行培养，每隔2
‑
6天，用
扩增培养基与所述成膜培养基进行交替更换，连续培养9
‑
15天；
[0012]S3：将培养基吸出，对所形成的细胞膜片表面进行清洗，将细胞膜片与皿壁剥离开，得到所述细胞膜片。
[0013]在一些实施方案中，所选取的人源间充质干细胞的融合度达80％
‑
90％、传代数为6
‑
8代。
[0014]在一些实施方案中，所述培养的条件为：37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。
[0015]在一些实施方案中，所述扩增培养基包括：基础培养基和添加物，所述添加物包括人血清白蛋白、L
‑
谷氨酰胺、非必须氨基酸、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、FGF、PDGF
‑
BB、IGF
‑
1、地塞米松中的一种或任意多种组合；所述成膜培养基包括：基础培养基和添加物，所述添加物包括抗坏血酸以及人血清白蛋白、L
‑
谷氨酰胺、非必须氨基酸、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、FGF、PDGF
‑
BB、IGF
‑
1、地塞米松中的一种或任意多种组合。
[0016]在一些实施方案中，所述扩增培养基的添加物包括：人血清白蛋白1
‑
5％、L
‑
谷氨酰胺1
‑
5mM、非必须氨基酸0.1
‑
1mg/mL，胰岛素1
‑
10ug/mL、转铁蛋白5
‑
20mg/mL、亚硒酸钠1
‑
50mg/mL、EGF 0.1
‑
10ng/mL、FGF 0.1
‑
5ng/mL、PDGF
‑
BB 1
‑
10ug/mL、IGF
‑
1 1
‑
10ug/mL、地塞米松2
‑
50nM。
[0017]在一些实施方案中，所述扩增培养基的添加物包括：人血清白蛋白2
‑
3％、L
‑
谷氨酰胺2
‑
3mM、非必须氨基酸0.2
‑
0.5mg/mL，胰岛素8
‑
10ug/mL、转铁蛋白18
‑
20ug/L、亚硒酸钠10
‑
20ug/L、EGF 8
‑
10ng/mL、FGF 1
‑
3ng/mL、PDGF
‑
BB 2
‑
4ug/mL、IGF
‑
1 1
‑
3ug/mL、地塞米松5
‑
10nM。
[0018]在一些实施方案中，所述扩增培养基的添加物包括：人血清白蛋白2％、L
‑
谷氨酰胺2mM、非必须氨基酸0.2mg/mL，胰岛素10ug/mL、转铁蛋白18
‑
20ug/L、亚硒酸钠20ug/L、EGF 10ng/mL、FGF 1ng/mL、PDGF
‑
BB 2ug/mL、IGF
‑
1 1ug/mL、地塞米松5nM。
[0019]在一些实施方案中，所述扩增培养基的基础培养基包括：DMEM/F12、a
‑
MEM、DMEM、IMDM、Knock out DMEM/F12中的任意一种；优选地，所述基础培养基包括a
‑
MEM。
[0020]在一些实施方案中，所述成膜培养基的添加物包括：人血清白蛋白1
‑
5％、L
‑
谷氨酰胺1
‑
5mM、非必须氨基酸0.1
‑
1mg/mL，胰岛素1
‑
10ug/mL、转铁蛋白5
‑
20mg/mL、亚硒酸钠1
‑
50mg/mL、EGF 0.1
‑
10ng/mL、FGF 0.1
‑
5ng/mL、PDGF
‑
BB 1
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备人源间充质干细胞膜片的方法，其特征在于，包括如下步骤：向贴壁生长的人源间充质干细胞中加入含有抗坏血酸的成膜培养基与不含有抗坏血酸的扩增培养基进行交替更换培养，形成细胞膜片；将细胞膜片与皿壁剥离开，得到所述细胞膜片。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：选取融合度达60％
‑
90％、传代数为4
‑
10代的人源间充质干细胞；S2：向贴壁生长的人源间充质干细胞中加入成膜培养基进行培养，每隔2
‑
6天，用扩增培养基与所述成膜培养基进行交替更换，连续培养9
‑
15天；S3：将培养基吸出，对所形成的细胞膜片表面进行清洗，将细胞膜片与皿壁剥离开，得到所述细胞膜片；优选地，所选取的人源间充质干细胞的融合度达80％
‑
90％、传代数为6
‑
8代；优选地，所述培养的条件为：37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。3.如权利要求1
‑
2任一所述的方法，其特征在于，所述扩增培养基包括：基础培养基和添加物，所述添加物包括人血清白蛋白、L
‑
谷氨酰胺、非必须氨基酸、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、FGF、PDGF
‑
BB、IGF
‑
1、地塞米松中的一种或任意多种组合；所述成膜培养基包括：基础培养基和添加物，所述添加物包括抗坏血酸以及人血清白蛋白、L
‑
谷氨酰胺、非必须氨基酸、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、EGF、FGF、PDGF
‑
BB、IGF
‑
1、地塞米松中的一种或任意多种组合。4.如权利要求1
‑
2任一所述的方法，其特征在于，所述扩增培养基的添加物包括：人血清白蛋白1
‑
5％、L
‑
谷氨酰胺1
‑
5mM、非必须氨基酸0.1
‑
1mg/mL，胰岛素1
‑
10ug/mL、转铁蛋白5
‑
20mg/mL、亚硒酸钠1
‑
50mg/mL、EGF 0.1
‑
10ng/mL、FGF 0.1
‑
5ng/mL、PDGF
‑
BB 1
‑
10ug/mL、IGF
‑
11
‑
10ug/mL、地塞米松2
‑
50nM；优选地，所述扩增培养基的添加物包括：人血清白蛋白2
‑
3％、L
‑
谷氨酰胺2
‑
3mM、非必须氨基酸0.2
‑
0.5mg/mL，胰岛素8
‑
10ug/mL、转铁蛋白18
‑
20ug/L、亚硒酸钠10
‑
20ug/L、EGF 8
‑
10ng/mL、FGF 1
‑
3ng/mL、PDGF
‑
BB 2
‑
4ug/mL、IGF
‑
11
‑
3ug/mL、地塞米松5
‑
10nM；优选地，所述扩增培养基的基础培养基包括：DMEM/F12、a
‑
MEM、DMEM、IMDM、Knock out DMEM/F12中的任意一种；优选地，所述基础培养基包括a
‑
MEM。5.如权利要求1
‑
2任一所述的方法，其特征在于，所述成膜培养基的添加物包括：人血清白蛋白1
‑
5％、L
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谷氨酰胺1
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5mM、非必须氨基酸0.1
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1mg/mL，胰岛素1
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10ug/mL、转铁蛋白5
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20mg/mL、亚硒酸钠1
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50mg/mL、EGF 0.1
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10ng/mL、FGF 0.1
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5ng/mL、PDGF
‑
BB 1
‑
10u...

【专利技术属性】
技术研发人员：马旭，袁国红，
申请(专利权)人：国家卫生健康委科学技术研究所，
类型：发明
国别省市：