一种血小板膜修饰的外泌体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种血小板膜修饰的外泌体及其制备方法与应用。本发明专利技术具体涉及一种血小板膜修饰的外泌体可以模拟血小板的归巢能力，靶向到局部斑块，被巨噬细胞吞噬，从而传递活性物质到靶细胞，调节巨噬细胞炎症水平。同时可以作为载体，包载蛋白、RNA和DNA等靶向局部斑块巨噬细胞。本发明专利技术显著提高血小板膜修饰的外泌体在斑块处巨噬细胞内的分布，提高血小板膜修饰的外泌体对与斑块局部炎症的调节作用，为治疗动脉粥样硬化提供新的抗炎药物。治疗动脉粥样硬化提供新的抗炎药物。治疗动脉粥样硬化提供新的抗炎药物。

【技术实现步骤摘要】
一种血小板膜修饰的外泌体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是涉及一种血小板膜修饰的外泌体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]动脉粥样硬化是心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)的主要病因。现如今，动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerosis cardiovascular disease,ASCVD)仍是世界范围内死亡的主要原因之一，其治疗方式以降血脂为金标准。动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，且基于近来大量临床试验的结果，抗炎治疗有望成为ASCVD新的治疗靶点。
[0003]2017年CANTOS研究首次肯定了动脉粥样硬化的炎症假说，证实了IL
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1β抗体可以显著降低患者心梗后心血管事件的发生风险(Weber,C.,and von Hundelshausen,P.CANTOS Trial Validates the Inflammatory Pathogenesis of Atherosclerosis.Circ Res,2017,121(10):1119
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21.)。COLCOT和LoDoCo2试验研究证明了秋水仙碱可以减少心肌梗死及慢性稳定性冠心病患者的主要心血管事件风险(Nidorf,S.M.,et al.,Colchicine in Patients with Chronic Coronary Disease.N Engl JMed,2020.383(19):1838
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1847；Tardif,J.
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C.,et al.,Efficacy and Safety of Low
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Dose Colchicine after Myocardial Infarction.N Engl J Med,2019.381(26):2497
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2505.)。系列研究表明炎症是独立于LDL
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C的ASCVD重要危险因素，控制炎症可以减少ASCVD的发生，这些为ASCVD的抗炎靶点提供了新的证据。尽管如此，抗炎药物由于不具有特异性分布，常常导致系统性的免疫抑制，诱发严重感染等副作用。因此，针对局部斑块的给药方式，旨在有效减轻斑块炎症却不影响全身免疫反应则尤为重要。
[0004]动脉粥样硬化的典型病理特征是内皮受损、脂质沉积和炎症细胞浸润。血管内皮的受损导致其分泌大量黏附分子介导白细胞在斑块局部募集，其中，巨噬细胞是斑块处白细胞的主要成分。迁移到内膜处的巨噬细胞受到局部微环境刺激分泌炎症因子、活性氧自由基加剧氧化应激。源源不断的脂蛋白
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胆固醇被巨噬细胞吞噬，逐渐发展成泡沫细胞，进一步诱发了慢性炎症。由此可见，巨噬细胞在斑块炎症反应中发挥了重要作用，特异性地针对巨噬细胞递送抗炎药物或将有效阻止AS进展并消退斑块。
[0005]据报道，间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)在治疗AS中具有重要价值，可以减少内皮功能障碍、调节巨噬细胞功能和抑制泡沫细胞形成(Li,F.,X.Guo,and S.
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Y.Chen,Function and Therapeutic Potential of Mesenchymal Stem Cells in Atherosclerosis.Front Cardiovasc Med,2017.4(32))。近年来，人们发现MSC发挥功能主要依赖于分泌的外泌体。这是一种干细胞分泌的膜样细胞外囊泡，浓缩了MSC的大量活性物质，因此既继承了MSC的功能作用，又避免了细胞治疗导致的致瘤性、栓塞、存活率低等问题。截止2022年6月，全球最大的临床试验数据库Clinical Trial中注册的外泌体临床研究已逾180项。基于此，间充质干细胞外泌体(MSC
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Exo)可能较MSC本身在AS治疗中更具有应用前景。然而，外泌体在体内的半衰期短，易被肝脾网状内皮系统清除，且靶向性不足，往往仅
有少量的外泌体可以顺利抵达靶器官、靶细胞。目前对于外泌体的修饰，多为在其表面修饰靶向分子或对其母细胞加以基因重编程，但以上途径应用于心血管系统均存在一定缺陷。一是因为到达心血管系统需要足够长的循环能力，二是心血管系统环境复杂，仅靠单一的分子靶向无法实现有效的靶向性。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的就是为了克服上述技术缺陷而提供一种血小板膜修饰的外泌体及其制备方法与应用。
[0007]其一，本专利技术为了解决外泌体体内靶向性差，靶器官分布不足的问题，提供了一种新的外泌体修饰方法，赋予其靶向局部斑块的能力，即一种可以靶向局部斑块成分的血小板膜修饰的外泌体。
[0008]其二，本专利技术为治疗动脉粥样硬化提供了一种新的治疗策略，经过血小板膜修饰的外泌体能明显提高斑块局部抗炎效果，抑制AS进展。
[0009]其三，本专利技术为靶向性递送物质(包括蛋白、RNA、DNA和药物)到斑块处巨噬细胞提供了新的载体。
[0010]本专利技术构建了一种血小板膜修饰的外泌体(P
‑
EV)，该血小板膜修饰的外泌体继承了血小板靶向斑块成分的能力，同时保留了外泌体本身的治疗价值，通过静脉注射，探究了血小板膜修饰的外泌体在体内外靶向并调节斑块巨噬细胞的能力，验证其在AS治疗中发挥的抗炎作用。
[0011]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0012]本专利技术的技术方案之一：提供一种外泌体，该外泌体是血小板膜修饰的外泌体。
[0013]本专利技术的技术方案之二：提供一种血小板膜修饰的外泌体的制备方法。通过膜融合法，利用挤压器连续挤压融合血小板膜和外泌体得到血小板膜修饰的外泌体(P
‑
EV)。
[0014]进一步地，所述血小板膜来自C57BL/6小鼠外周血的血小板。
[0015]进一步地，所述外泌体来自C57BL/6小鼠间充质干细胞(mMSC)上清。
[0016]进一步地优选10mL上清提取6.13x 10
10
个EV囊泡(28.33
±
5.51μg蛋白含量)，与等量血小板膜融合。
[0017]进一步地，采用透射电镜(TEM)、纳米颗粒追踪分析(NTA)、动态光散射(DLS)、酶标仪对P
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EV的形态、粒径大小、分布、电位及稳定性进行表征。
[0018]进一步地，采用纳米流式(NFC)、荧光共振能量转移(FRET)、激光共聚焦显微镜、聚丙烯胺凝胶电泳(SDS
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PAGE)对膜融合进行验证。
[0019]进一步地，通过小RNA测序分析P
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EV经血小板膜修饰后与修饰前的差异性，GO和KEGG富集分析P
‑
EV的作用靶点。
[0020]进一步地，通过激光共聚焦显微镜、流式细胞术对P
‑
EV模拟血小板黏附受损人脐静脉内皮细胞(H本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体，其特征在于，所述外泌体是血小板膜修饰的外泌体。2.一种如权利要求1所述外泌体的制备方法，其特征在于，通过挤压器连续挤压融合血小板膜和外泌体得到血小板膜修饰的外泌体。3.根据权利要求2所述的一种外泌体的制备方法，其特征在于，所述的血小板膜来自C57BL/6小鼠外周血的血小板。4.根据权利要求2所述的一种外泌体的制备方法，其特征在于，所述的外泌体来自C57BL/6小鼠间充质干细胞上清。5.一种如权利要求1所述外泌体的应用，其特征在于，所述外泌体在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。6.根据权利要求5所述的一种外泌...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄浙勇，宋亚楠，李琦玉，钱菊英，葛均波，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：