一种降低血清培养体系中细胞制剂BSA残留量的方法技术

本发明专利技术公开了一种降低血清培养体系中细胞制剂BSA残留量的方法，包括以下步骤：S1：清洗：在细胞制剂收集前，细胞生长融合率达到80％

【技术实现步骤摘要】
一种降低血清培养体系中细胞制剂BSA残留量的方法


[0001]本专利技术属于生物细胞学领域，尤其涉及一种降低血清培养体系中细胞制剂BSA残留量的方法。

技术介绍

[0002]人脐带间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。传统的人脐带间充质干细胞培养液，是含10％FBS(fetal bovine serum，胎牛血清)的培养基，FBS能够维持人脐带间充质干细胞体外培养的干细胞特性，对于人脐带间充质干细胞的贴壁、分裂和增殖有着重要作用。且胎牛血清是病毒性疫苗生产过程中必不可少的营养成分。但胎牛血清中含有BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)，在干细胞成品疫苗中，BSA作为一种异源蛋白对接种疫苗的患者的健康可能造成潜在的危害，作为过敏原引起过敏反应，尤其是对过敏体质人群和儿童危害极大；同时，BSA可能携带一定种类的动物性病毒，如具有传播TSE(Transmissible Spongiform Encephalopathy，可传染性海绵状脑病)和BSE(Bovine Spongiform Encephalopathy，疯牛病)的潜在危险。因此《中国生物制品规程》对其进行质控，要求每人份疫苗中残余牛血清白蛋白的含量不得高于50ng/剂。
[0003]传统含血清的细胞制剂培养方式，得到的成品中BSA残留高达137.99ng/剂，远大于50ng/剂，不符合《中国生物制品规程》对疫苗的质控要求。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种降低血清培养体系中细胞制剂BSA残留量的方法，该方法使得血清培养体系中细胞制剂BSA的含量明显降低，满足《中国生物制品规程》对疫苗的质控要求，即每人份疫苗中残余牛血清白蛋白的含量不得高于50ng/剂。
[0005]为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0006]一种降低血清培养体系中细胞制剂BSA残留量的方法，包括以下步骤：
[0007]S1：清洗：在细胞制剂消化收集前，细胞生长融合率达到80％
‑
90％，将细胞与完全培养基分开，采用生理盐水清洗细胞；
[0008]S2：饥饿培养：将清洗后的细胞在基础培养基内饥饿培养0
‑
20h(不包括0)，然后清洗、消化、收集细胞；
[0009]其中，完全培养基为FBS和基础培养基的混合培养基。
[0010]优选地，所述步骤S1和S2中，采用100
‑
400ml生理盐水清洗细胞。
[0011]优选地，所述步骤S1和S2中，采用生理盐水清洗细胞1
‑
3次。
[0012]优选地，在所述步骤S1和S2中，采用250ml生理盐水清洗细胞1次。
[0013]优选地，其特征在于，在所述步骤S2中，将清洗后的细胞在基础培养基内饥饿培养
16
‑
18h。
[0014]优选地，所述完全培养基中含有10％FBS。
[0015]优选地，所述步骤S2中，清洗后的细胞在培养瓶中贴壁培养，将培养瓶放入37℃，5％CO2培养箱中培养0
‑
20h。
[0016]优选地，所述细胞制剂中BSA的含量低于30ng/剂，优选地，低于22.05ng/剂。
[0017]本专利技术由于采用以上技术方案，使其与现有技术相比具有以下的优点和积极效果：
[0018]本申请在细胞消化收集前进行生理盐水清洗加血清饥饿后，再进行消化收集。采用本申请的方法得到的细胞中BSA残留量明显降低，满足《中国生物制品规程》对疫苗的质控要求，解决了血清培养体系中细胞BSA残留量高的问题。
附图说明
[0019]图1为实施例1中生理盐水清洗参数实验设计结果图；
[0020]图2为实施例1中血清饥饿实验设计结果图；
[0021]图3为实施例1中清洗参数结合血清饥饿时间实验设计结果图；
[0022]图4为实施例2和对比例1处理后的细胞制剂的BSA含量结果图。
具体实施方式
[0023]以下结合附图和具体实施例对本专利技术提出的一种降低血清培养体系中细胞制剂BSA残留量的方法作进一步详细说明。根据下面说明，本专利技术的优点和特征将更清楚。
[0024]本专利技术针对现有技术的缺点，提出一种降低血清培养体系中细胞制剂BSA残留量的方法，包括以下步骤：
[0025]S1：清洗：在细胞制剂收集前，细胞生长融合率达到80％
‑
90％，将细胞与完全培养基分开，采用生理盐水清洗细胞；
[0026]S2：饥饿培养：将清洗后的细胞在基础培养基内饥饿培养0
‑
20h，然后清洗、消化、收集细胞；
[0027]其中，完全培养基为FBS和基础培养基的混合培养基。
[0028]本专利技术的方法适合采用血清培养体系的细胞，对于细胞来源不限定，只要其可以采用血清培养即可。
[0029]本专利技术涉及到生理盐水清洗细胞，以及基础培养基饥饿培养三个重要的工艺参数，以下实施例1中从生理盐水的清洗用量、清洗次数和饥饿培养时间三个重要参数进行探究。
[0030]在本专利技术实施例1
‑
2和对比例1中细胞培养均采用培养瓶贴壁培养方式，培养的细胞种类为人脐带间充质干细胞，采用的培养瓶为十层瓶(厂家：CORNIG)，细胞接种密度为1.215
×
104个细胞/cm2，冻存的细胞代次均为P6，采用的生理盐水为0.9％氯化钠注射液，采用的基础培养基购买于(生产厂家：Gibco)，完全培养基为基础培养基和FBS(生产厂家：Gibco)的混合液，其中FBS占有完全培养基的10％。
[0031]实施例1
[0032]1、对清洗用量和清洗次数进行实验设计
[0033]在细胞制剂收集消化前，细胞的生长融合率达到80％
‑
90％时，设置不同的生理盐水用量及不同的清洗次数清洗细胞表面，再进行后续消化收集，即将培养瓶中的完全培养基全部倒出，分别采用100ml、250ml、400ml清洗培养瓶中的细胞，清洗1
‑
3次，再进行后续消化收集细胞，将细胞按1
×
107个细胞/ml，1ml/管进行冻存，检测其BSA含量，故数据统计图(图1、图2、图3)BSA含量的单位为ng/ml。
[0034]实验设置如表1所示：
[0035][0036]实验结果如图1所示，从图1中可以看出，生理盐水使用量为100ml时注射液成品中BSA残留量最高，生理盐水使用量为250ml、400ml时注射液成品中BSA残留量较低且相差不大，但考虑到使用400ml生理盐水会增加操作时长，风险较大，导致可操作性差，故清洗用量优选为250本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种降低血清培养体系中细胞制剂BSA残留量的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：清洗：在细胞制剂收集前，细胞生长融合率达到80％
‑
90％，将细胞与完全培养基分开，采用生理盐水清洗细胞；S2：饥饿培养：将清洗后的细胞在基础培养基内饥饿培养0
‑
20h，然后清洗、消化、收集细胞；其中，完全培养基为FBS和基础培养基的混合培养基。2.根据权利要求1所述的降低血清培养体系中细胞制剂BSA残留量的方法，其特征在于，所述步骤S1和S2中，采用100
‑
400ml生理盐水清洗细胞。3.根据权利要求2所述的降低血清培养体系中细胞制剂BSA残留量的方法，其特征在于，所述步骤S1和S2中，采用生理盐水清洗细胞1
‑
3次。4.根据权利要求3所述的降低血清培养体系中细胞制剂BSA残留量的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁培杏，谭祝平，顾燕凤，李兰花，王丽倩，郑鹏龙，王志强，王皓，齐念民，
申请(专利权)人：浙江泉生生物科技有限公司，
类型：发明
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