培养脂肪间充质干细胞制备外泌体制造技术

本发明专利技术涉及培养脂肪间充质干细胞制备外泌体。一方面，本发明专利技术涉及使用脂肪间充质干细胞分离提取的外泌体，其具有50～200nm的平均粒径，膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％，膜蛋白CD81的阳性表达率大于80％；该外泌体是使用IL

【技术实现步骤摘要】
al.Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.Stem cell research.2010；4(3):214
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22.)。Xin等发现MSCs来源的外泌体通过转移miR
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133b到神经细胞，可促进神经轴突的生长(可参见：Xin H,Li Y,Buller B,Katakowski M,Zhang Y,Wang X,et al.Exosome mediated transfer of miR
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133b from multipotent mesenchymal stromal cells to neural cells contributes to neurite outgrowth.Stem cells.2012；30(7):1556
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64.)。Filipazzi等发现肿瘤细胞来源的外泌体可通过NK细胞激活型受体NKG2D(naturalkiller group 2,member D)抑制T细胞和NK细胞的细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.使用脂肪间充质干细胞分离提取的外泌体，其具有50～200nm的平均粒径，膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％，膜蛋白CD81的阳性表达率大于80％；该外泌体是使用脂肪间充质干细胞通过包括如下步骤的方法制备得到的：(1)将脂肪间充质干细胞接种至培养瓶中，添加MSC完全培养基，置37℃、5％CO2培养箱中培养使细胞贴壁，再向培养液中添加IL
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1β至浓度8～12ng/mL，继续培养；脂肪间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：(a)在生物安全柜中处理经2
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8℃冷链运输至实验室的脂肪样本；(b)使脂肪样本离心，移取上层脂肪组织，再使用D
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Hanks液清洗一遍，再次离心，移取脂肪组织，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；(c)消化结束后，加一倍体积D
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hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；(d)取步骤(c)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO2培养箱中培养；所述原代增补培养基是以DMEM
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F12培养基为基质配制并加入：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖；(e)培养3d后培养基全换液一次，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D
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hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D
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hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞；(f)使原代脂肪间充质干细胞以步骤(d)至步骤(e)的方式纯化培养和传代，得P1代细胞；以此类推，依次得到P2～P8代间充质干细胞；(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％CO2培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；(3)吸弃培养基，用PBS清洗，然后添加MSC完全培养基，再置于37℃、2％O2、5％CO2培养箱中培养42～56小时；(4)吸取细胞上清液置离心管中，进行如下离心处理：以250～350g、4℃离心8～12分钟，吸取上清液至另一离心管中；以1500～2500g、4℃离心18～25分钟，吸取上清液至另一离心管中；以8000～12000g、4℃离心25～35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管中；以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清；(5)向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清液，加无菌PBS使外泌体重悬，得到呈悬液形式的外泌体。2.根据权利要求1的外泌体，其中，步骤(b)中，两次离心均以100xg离心5min的条件进行操作；和/或，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；步骤(c)中，离心以100xg离心5min的条件进行操作；步骤(d)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量1～5
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104/cm2接种至T75瓶；和/或，步骤(d)中，CO2培养箱中培养的条件为：5％CO2，37℃，饱和湿度；和/或，步骤(e)中每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min；和/或，步骤(e)中以100xg离心
10min；和/或，步骤(e)中每瓶加入10ml的D
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hanks液稀释。3.根据权利要求1的外泌体，其中，所述D
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Hanks液的配方组成如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml；和/或，所述DMEM
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F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L
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亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L
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赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L
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蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L
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苯丙氨酸35.48mg、1,4
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丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L
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丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L
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苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L
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丙氨酸4.45mg、D
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泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L
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天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L
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天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L
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半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i
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肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L
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谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L
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精氨酸盐酸盐147.5mg、L
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脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L
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胱氨酸盐酸盐31.29mg、L
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色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L
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谷氨酰胺365mg、L
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酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L
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【专利技术属性】
技术研发人员：魏卿，肖海蓉，刘庆喜，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：