一种脐带干细胞外泌体提取方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物医学技术领域，特别涉及一种脐带干细胞外泌体提取方法及应用。采用无血清培养基培养，克服了动物源性血清污染的缺陷和并解决了细胞扩增数量和维持干细胞特性的问题，不含血清，避免了不明血清成份对细胞培养的影响和动物源性的污染，促进细胞增殖并维持干细胞特性，采用PEG交联成网状，附着外泌体；通过加入蔗糖溶液进行外泌体保护，避免了外泌体在超速离心过程中遭到地破坏，从而稳定外泌体、减少超速离心的机械损伤导致外泌体破裂带来的碎片，提高外泌体提取物的纯度，整体操作步骤操作简单，耗时较短，且提取的干细胞外泌体纯度高，适合批量化提取，制得的干细胞外泌体作为活性成分，能够在解决人的皮肤老化问题。问题。

【技术实现步骤摘要】
一种脐带干细胞外泌体提取方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，特别涉及一种脐带干细胞外泌体提取方法及应用。

技术介绍

[0002]干细胞外泌体是来自干细胞的一种细胞分泌物，外泌体是干细胞分泌微小的囊泡(宽30至150纳米)，它带上有干细胞的蛋白、mRNA和microRNA等生物活性化学物质，具备干细胞的一些功能。外泌体合乎纳米颗粒的界定，干细胞外泌体可以透过血脑屏障，是干细胞与别的细胞中间信息内容传送的关键物质，有利于干细胞功能的完成。它们类似细胞间的“通信兵”可以在细胞之间转移DNA，RNA或蛋白质，从而影响受体细胞的功能，在干细胞和再生医学领域，外泌体正在被用于以治疗从心脏病到呼吸系统疾病的疾病。
[0003]干细胞外泌体与干细胞具有相似的生物学性能，但干细胞外泌体更加安全稳定高效，外泌体对受损的微环境不响应，具有更强而复杂的信号分子转运和调控能力，具有改变细胞外基质，改变受体细胞的转录组和蛋白质组，调节细胞凋亡，生长，增殖和分化途径的能力。外泌体中包含多种生物因子，这些因子被发现可诱导成纤维细胞的迁移和增殖以及胶原的合成；具有减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要生物学功能，在组织损伤修复、慢性伤口愈合、抑制伤口瘢痕形成及抗衰老等方面具有良好的应用前景。而获得高纯度的干细胞外泌体展开应用研究的前提。目前市场上传统的精华液主要是利用外源性物质，如通过植物成分提取或精细化工制作工艺加工而成的，虽然对肌肤能产生短暂的改善效果，但并未从根本上改变皮肤的衰老和修复问题。

技术实现思路

[0004]针对以上述
技术介绍
的不足，本专利技术提供一种脐带干细胞外泌体提取方法及应用。
[0005]一方面，本专利技术采用的技术方案如下：一种脐带干细胞外泌体提取方法，关键在于在于，包括以下步骤：
[0006]S1.采用无血清培养基在恒温无菌环境中提取外泌体原液；
[0007]S2.将外泌体原液与PEG混合后，使得PEG的浓度在1.6
‑
2.5％之间，孵育1～ 3h,获得稳定的外泌体交联体系；
[0008]S3.加入外泌体提取液，获得外泌体超速离心体系；
[0009]S4.将获得的外泌体进行密度梯度离心收集，获得高纯度外泌体；
[0010]S5.冷冻储存，对培养后的干细胞外泌体进行深低温冷藏。
[0011]优选的，所述S1中的所述无血清培养基包括DMEM
‑
F12培养基、血小板源性因子1
‑
50ng/mL、碱性成纤维生长因子20
‑
50ng/mL芦荟抽提物10
‑
50ng/mL人参抽提物10
‑
50ng/mL、肉苁蓉抽提物，10
‑
50ng/mL。
[0012]优选的，S1具体为收集干细胞培养液上清，去除细胞碎片及杂质，获得外泌体原
液，优选在相对离心力200g～300g下离心8
‑
10分钟去除细胞碎片。
[0013]优选的，S2中PEG分子量在4000
‑
6000，控制孵育温度在2～6℃。
[0014]优选的，S3具体为加入45％wt的蔗糖溶液直到外泌体超速离心体系中蔗糖质量分数为10
‑
15％。
[0015]优选的，S4离心条件2
‑
6℃、110000g低温离心1
‑
2h。
[0016]优选的，S5冷冻储存时，需要在
‑
80℃的环境下对所提取的干细胞外泌体进行保存。
[0017]另一方面，本专利技术提供一种脐带干细胞外泌体在美容制剂中的应用。
[0018]另一方面，本专利技术提供一种抗衰老美容产品，包括以上方法提取的脐带干细胞外泌体。
[0019]有益效果：与现有技术相比，本专利技术采用无血清培养基培养，克服了动物源性血清污染的缺陷和并解决了细胞扩增数量和维持干细胞特性的问题，不含血清，避免了不明血清成份对细胞培养的影响和动物源性的污染，促进细胞增殖并维持干细胞特性，采用PEG交联成网状，附着外泌体；通过加入蔗糖溶液进行外泌体保护，在此基础之上进行超速离心富集并提纯外泌体，避免了外泌体在超速离心过程中遭到地破坏，从而稳定外泌体、减少超速离心的机械损伤导致外泌体破裂带来的碎片，提高外泌体提取物的纯度，整体操作步骤操作简单，耗时较短，且提取的干细胞外泌体纯度高，适合批量化提取，制得的干细胞外泌体作为活性成分，能够在解决人的皮肤老化问题。
具体实施方式
[0020]为使本领域技术人员更好的理解本专利技术的技术方案，下面结合具体实施方式对本专利技术作详细说明。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的工业原料(试剂、原料视情况选择)如无特别说明，均为市售常规工业原料；所涉及的加工制作方法(检测、测试、制备方法等视情况而选择)，如无特别说明，均为常规方法。
[0021]实施例1脐带间充质干细胞的提取
[0022]从保存液中取出脐带，物理破碎脐带，去除脐带结扎两端外侧，中间段剪成1～2cm长的小段，用生理盐水反复冲洗脐带小段，剖开，去除其动脉、静脉，用生理盐水反复冲洗去除血液和血块，用10倍双抗浸泡后用剪刀剪碎至0.5～ 2mm3，得到脐带组织碎块；将脐带组织碎块采用I型胶原酶溶液、EDTA溶液、胰蛋白酶的顺序消化，每次消化的条件为：温度36～38℃，时间20～30min，终止消化后，用生理盐水洗两次，用100um网筛过滤组织残渣，收集含细胞的滤液，洗涤离心得到的间充质干细胞；将脐带间充质干细胞接种于无血清培养基，所述无血清培养基包括DMEM
‑
F12培养基、血小板源性因子15ng/mL、碱性成纤维生长因子35ng/mL、芦荟抽提物35ng/mL、人参抽提物10ng/mL、肉苁蓉抽提物40ng/mL，在温度为37℃，二氧化碳体积比为5％、氧气的体积比为 6％的培养箱中孵育15
‑
25h，更换新的培养基，待间充质干细胞数量达到85％融合度时，按1:3比例传代培养，各代培养所用的脂肪间质干细胞的细胞密度为 2000个细胞/cm2，测试结果见下表1。
[0023]表1
[0024]代数细胞存活数量增加倍数存活率P12.47
×
106117.896.7％
P23.24
×
106154.697.1P31.78
×
10684.995.8
[0025]实施例2脐带干细胞外泌体提取
[0026]将实施例1中细胞培养后的培养基，离心去除杂质，收集干细胞培养液上清，去除细胞碎片及杂质，获得外泌体原液，优选在相对离心力200g～300g 下离心8
‑
10分钟去除细胞碎片，得外泌体原液；将外泌体原液与浓度在1.6
‑
2.5％，分子量为4000
‑
6000的PE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脐带干细胞外泌体提取方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.采用无血清培养基在恒温无菌环境中提取外泌体原液；S2.将外泌体原液与PEG混合后，使得PEG的浓度在1.6
‑
2.5％之间，孵育1～3h,获得稳定的外泌体交联体系；S3.加入外泌体提取液，获得外泌体超速离心体系；S4.将获得的外泌体进行密度梯度离心收集，获得高纯度外泌体；S5.冷冻储存，对培养后的干细胞外泌体进行深低温冷藏。2.根据权利要求1所述的一种脐带干细胞外泌体提取方法，其特征在于所述S1中的所述无血清培养基包括DMEM
‑
F12培养基、血小板源性因子1
‑
50ng/mL、碱性成纤维生长因子20
‑
50ng/mL芦荟抽提物10
‑
50ng/mL人参抽提物10
‑
50ng/mL、肉苁蓉抽提物，10
‑
50ng/mL。3.根据权利要求1所述的一种脐带干细胞外泌体提取方法，其特征在于S1具体为收集干细胞培养液上清，去除细胞碎片及杂质，获得外泌体原液...

【专利技术属性】
技术研发人员：李本金，郝建华，
申请(专利权)人：北京北美抗衰老医学研究院，
类型：发明
国别省市：