促进干细胞外泌体分泌的培养液、外泌体制备及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种促进干细胞外泌体分泌的培养液、外泌体制备及应用，该培养液中包括基础培养基、重组人胰岛素1~10mg/L、人转铁蛋白5~10mg/L、重组人纤连蛋白20~40mg/L、人血清白蛋白1~5g/L、维生素C 50~200mg/L、维生素B6 5~20mg/L、维生素B1 60~150mg/L、维生素A 20~50mg/L、EGF 2~10μg/L、bFGF10~20μg/L、β

【技术实现步骤摘要】
12mg/L、维生素B1 110mg/L、维生素A 36mg/L、EGF 6μg/L、bFGF 15μg/L、β
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巯基乙醇11mg/L、谷胱甘肽3mg/L及3umol/L的长梗秦艽酮。
[0009]一实施例，所述培养液中，所述基础培养基为a
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MEM或DMEM。
[0010]本专利技术所要解决的技术方案二如下：一种间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：获取间充质干细胞；将所述间充质干细胞接种至盛有培养液中的培养器中，进行静态培养；其中，所述培养液采用上述培养液；培养结束后，对培养器中的培养液收集后进行离心处理，吸取保留上清液，获得间充质干细胞外泌体溶液。
[0011]一实施例，所述制备方法中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞及胎盘间充质干细胞中的任一种。
[0012]一实施例，所述制备方法中，所述间充质干细胞的静态培养过程中，所述培养器内的O2浓度在5~8v/v％、CO2浓度为5 v/v％，温度控制在37℃，培养时间为96小时。
[0013]一实施例，所述制备方法中，离心处理时，离心力为1500~2500g，离心时间为8~15分钟。
[0014]上述方法制得间充质干细胞外泌体，可以在人体机能免疫调节、预防或治疗肝脏疾病药物中的得到应用。
[0015]本专利技术提供的培养液，其组分长梗秦艽酮具有一定的抗肿瘤作用，同时还能促进间充质干细胞抗炎细胞因子（即外泌体）的分泌，使得外泌体的分泌浓度达到8.9*106颗粒/mL，远大于对比例外泌体的分泌浓度3.2*106或5.7*106颗粒/mL；同时，低氧（O2浓度在5~8v/v％）环境下培养，可以促进间充质干细胞的分泌活动，有效提高外泌体的浓度。
附图说明
[0016]图1为实施例1中外泌体颗粒浓度浓度测定图；图2为对比例1中外泌体颗粒浓度浓度测定图；图3为对比例2中外泌体颗粒浓度浓度测定图；图4为实施例1、对比例1、对比例2中的模拟受损L02细胞中LDH含量水平柱状图；图5为实施例1、对比例1、对比例2中的模拟受损L02细胞中AST含量水平柱状图；图6为实施例1、对比例1、对比例2中的模拟受损L02细胞分泌的总蛋白量柱状图；图7为实施例1、对比例1、对比例2中的模拟受损L02细胞凋亡率柱状图；图8为实施例1、对比例1、对比例2中的模拟受损L02细胞活率柱状图。
具体实施方式
[0017]下面结合附图，对本专利技术的较佳实施例作进一步详细说明。
[0018]本专利技术提供的促进间充质干细胞分泌外泌体的培养液，包括基础培养基，如，无血清培养基、a
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MEM、DMEM或RPMI
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1640等；在基础培养基中包含有：重组人胰岛素1~10mg/L、人转铁蛋白5~10mg/L、重组人纤连蛋白20~40mg/L、人血清白蛋白1~5g/L、维生素C 50~200mg/L、维生素B6 5~20mg/L、维生素B1 60~150mg/L、维生素A 20~50mg/L、EGF 2~10μg/L、bFGF10
~20μg/L、β
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巯基乙醇5~15mg/L、谷胱甘肽1~5mg/L及1~5umol/L的长梗秦艽酮。
[0019]在一个较好的实施例中，基础培养基中包括有：重组人胰岛素2~8mg/L、人转铁蛋白6~8mg/L、重组人纤连蛋白25~35mg/L、人血清白蛋白2~4g/L、维生素C 80~160mg/L、维生素B6 10~15mg/L、维生素B1 80~120mg/L、维生素A 30~40mg/L、EGF 5~8μg/L、bFGF 14~18μg/L、β
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巯基乙醇8~12mg/L、谷胱甘肽2~4mg/L及2~4umol/L的长梗秦艽酮；其中，所述基础培养基为a
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MEM或DMEM。
[0020]在一个更优的实施例中，上述基础培养基中包括：重组人胰岛素5mg/L、人转铁蛋白7mg/L、重组人纤连蛋白31mg/L、人血清白蛋白3.2g/L、维生素C 100mg/L、维生素B6 12mg/L、维生素B1 110mg/L、维生素A 36mg/L、EGF 6μg/L、bFGF 15μg/L、β
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巯基乙醇11mg/L、谷胱甘肽3mg/L及3umol/L的长梗秦艽酮；其中，所述基础培养基为a
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MEM或DMEM。
[0021]为了获得含量更高的间充质干细胞外泌体，本专利技术采用工艺步骤：S1、从间充质干细胞培养种子库中获取间充质干细胞；S2、将间充质干细胞接种至盛有培养液中的培养器中，进行静态培养；其中，培养液采用上述任一种培养液；S3、培养结束后，对培养器中的培养液收集后进行离心处理，吸取保留上清液，获得间充质干细胞外泌体溶液。
[0022]上述步骤S1中，间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞及胎盘间充质干细胞中的任一种。各种干细胞培养获取，属于现有技术，在此不再赘述。
[0023]上述步骤S2中，间充质干细胞的静态培养过程时，培养器内的O2浓度控制在5~8v/v％、CO2浓度为5 v/v％，温度控制在37℃，培养时间为96小时；其中，O2浓度是采用通入N2、CO2混合气体来控制；培养器可以是T175或T75培养瓶、细胞工厂（如，四层、十层细胞工厂）。
[0024]上述步骤S3中，离心处理时，离心力为1500~2500g，离心时间为8~15分钟；优选，离心力为2000g，离心时间为10分钟。
[0025]本专利技术的间充质干细胞外泌体，可以在人体机能免疫调节、预防或治疗肝脏疾病药物中的得到应用，如，急性和慢性肝炎、代谢性肝病、肝硬化的自身免疫和并发症以及肝细胞癌药物中起到抑制剂作用。
[0026]对于外泌体使用的检测，主要通过下述手段进行。
[0027]1、MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下,外源性MT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒( Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MT结晶形成的量与活细胞数成正比。数值最高，说明受损的L02细胞的生长也快，也间接说明细胞受损恢复得越快或者说健康的L02细胞生长快于受损死亡的L02细胞。
[0028]2、LDH，也叫乳酸脱氢酶，是糖的无氧酵解和糖异生的重要酶系之一。LDH广泛存在于人体组织中，以肾脏含量最高，其次是心肌、骨骼肌，红细胞内含量约为正常血清的100倍。乳酸脱氢酶是人体内糖酵解途径中至关重要的氧化还原酶，能够可逆的催化乳酸，使之氧化为丙酮酸，提供人体的能量来源。
[0029]乳酸脱氢酶的测定常用于诊断心肌梗死、肝脏疾病和某些恶性肿瘤，乳酸脱氢酶
升高，常见于心肌梗死、肝脏疾病，比本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进间充质干细胞分泌外泌体的培养液，其特征在于，该培养液中包括基础培养基、重组人胰岛素1~10mg/L、人转铁蛋白5~10mg/L、重组人纤连蛋白20~40mg/L、人血清白蛋白1~5g/L、维生素C 50~200mg/L、维生素B6 5~20mg/L、维生素B1 60~150mg/L、维生素A 20~50mg/L、EGF 2~10μg/L、bFGF10~20μg/L、β
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巯基乙醇5~15mg/L、谷胱甘肽1~5mg/L及1~5umol/L的长梗秦艽酮。2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，该培养液中包括基础培养基、重组人胰岛素2~8mg/L、人转铁蛋白6~8mg/L、重组人纤连蛋白25~35mg/L、人血清白蛋白2~4g/L、维生素C 80~160mg/L、维生素B6 10~15mg/L、维生素B1 80~120mg/L、维生素A 30~40mg/L、EGF 5~8μg/L、bFGF 14~18μg/L、β
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巯基乙醇8~12mg/L、谷胱甘肽2~4mg/L及2~4umol/L的长梗秦艽酮。3.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，该培养液中包括基础培养基、重组人胰岛素5mg/L、人转铁蛋白7mg/L、重组人纤连蛋白31mg/L、人血清白蛋白3.2g/L、维生素C 100mg/L、维生素B6 12mg/L、维生...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢海涛，薛卫巍，谢炜豪，
申请(专利权)人：广东先康达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：