二氧化钛/锌铝水滑石类氧化物纳米材料在寡核苷酸测序中的应用制造技术

本发明专利技术公开了TiO2/ZnAl

【技术实现步骤摘要】
二氧化钛/锌铝水滑石类氧化物纳米材料在寡核苷酸测序中的应用


[0001]本专利技术涉及寡核苷酸生化分析领域，具体涉及TiO2/ZnAl
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LDO纳米材料作为MALDI基质对寡核苷酸测序中的应用。

技术介绍

[0002]寡核苷酸是指由2
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30个核苷酸以磷酸二酯键连接而成的多核苷酸片段，其在生物遗传信息的存储、处理和表达中起着至关重要的作用。生物内源性的寡核苷酸如miRNA，与植物动物的生长、器官的发育，细胞的凋亡和增殖有关，还可调节造血干细胞的分化，调节癌基因和抑癌基因的表达。外源性的寡核苷酸如反义寡核苷酸可作为药物分子转染mRNA使目标基因沉默。此外，具有一定空间结构的核酸适配体作为寡核苷酸的一种，可与目标靶分子形成类似抗原
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抗体的复合物，继而广泛用于细胞成像、新药研发、与微生物检测等领域。因此，尽管寡核苷酸仅由4种核糖核酸构成，但不同排列组合所构成的丰富的一级序列信息使其具有完全不同的功能。
[0003]目前寡核苷酸序列的确定主要包括间接法和直接法两种，间接法主要是先将寡核苷酸反转录为相应的cDNA，然后用现有的DNA测序方法来对其cDNA序列进行测定并且最终推测出其原始序列，间接法通量较高但一定程度上存在反转录错配的可能性。直接法测序主要依靠RNA酶在RNA特定位点剪切或终止延伸，从而识别该位点核苷酸类型以达到测序的目的，直接法测序过程复杂且通量较低因此缺乏广普性。质谱技术从不同核苷酸质荷比不同的角度出发对寡核苷酸进行测序，通过质谱解离技术使寡核苷酸碎裂产生不同断裂位点的片段，根据片段质荷比信息倒推序列信息，其得到的序列信息更丰富，准确度更高，通量更大。
[0004]关于利用质谱解离技术对寡核苷酸序列进行测定在早期的一些研究报道中大多采用碰撞诱导解离(Collision Induced Dissociation，CID)和高能碰撞解离(Higher Collisional Dissociation，HCD)技术。上述解离技术由于二次解离所产生的碎片类型及噪音信号较多使得谱图复杂，且大多数碎片峰信号较低，对碎片峰的归属造成难度。近年来与红外激光发射器耦合的红外多光子解离技术(Infra
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Red Multi
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Photon Dissociation，IRMPD)或与紫外激光发射器耦合的紫外激光解离技术(Ulta
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Violet Photon Dissociation，UVPD)使得待测寡核苷酸首先吸收能量处于高能状态再进行解离，能够提供较高的序列覆盖度，但也存在碱基部分二次丢失的问题，使得修饰位点无法得知，且由于需要与激光器耦合对实验条件的要求较高。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现行的寡核苷酸测序技术的技术问题，克服上述
技术介绍
中提到的不足和缺陷，提供TiO2/ZnAl
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LDO纳米材料作为MALDI基质对寡核苷酸测序中的应用，具体为一种快速、高通量，谱图简单易解析且不与其他设备耦合的直接质谱测序方法。利用TiO2/
ZnAl
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LDO纳米材料作为基质，在基质辅助激光解吸电离行时间质谱中，溶剂分子在激光的诱导下在纳米颗粒的表面生成羟基自由基或甲醇自由基等活性分子，活性分子进攻寡核苷酸磷酸骨架在不同位点产生a、b、c、d、w、x、y、z型碎片离子，不同长度的寡核苷酸碎片由于质荷比的不同能够在质谱内产生特征信号峰，根据信号峰的质荷比可归属为不同碎片离子即可拼凑出寡核苷酸序列。
[0006]TiO2/ZnAl
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LDO纳米材料(即二氧化钛/锌铝水滑石类氧化物纳米材料)作为MALDI基质对寡核苷酸测序中的应用。
[0007]所述寡核苷酸长度在2
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30nt，更优选2
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10nt，最优选为2
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6nt。
[0008]所述的应用，其特征在于，具体包括：
[0009]1)、基质制备：
[0010]制备TiO2/ZnAl
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LDO纳米材料，通过溶解基质的溶剂配制TiO2/ZnAl
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LDO纳米材料溶液；
[0011]2)、样品制备：
[0012]配制待测寡核苷酸的水溶液；
[0013]3)、靶板点样：
[0014]分别取等体积的待测寡核苷酸溶液和TiO2/ZnAl
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LDO纳米材料基质溶液，采用薄层法进行点样和干燥，获得点样后的靶板；
[0015]4)、点样后的靶板送入MALDI质谱仪，进行MALDI质谱分析。
[0016]步骤1)中，制备TiO2/ZnAl
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LDO纳米材料，具体包括：
[0017]1.1)将Zn(NO3)2·
6H2O和Al(NO3)3·
9H2O溶解在水中，超声使其充分溶解并记为A液；
[0018]1.2)将Na2MoO4·
2H2O和NaOH溶于水中超声并作为B液；
[0019]1.3)将A液和B液分别放入两个滴漏斗中，然后将其滴入20～30℃的包含TiO2的水中，同时控制滴速，使溶液的pH为8.5～9.5，滴完后，继续在20～30℃下搅拌20～40min，并于搅拌晶化，离心，洗涤至中性，干燥，并在350～450℃马弗炉中煅烧2～4h，得到TiO2/ZnAl
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LDO纳米材料。
[0020]步骤1.3)中，60～70℃搅拌晶化10～14h。
[0021]步骤1)中，所述的溶解基质的溶剂为甲醇、水或甲醇与水的混合溶剂。
[0022]步骤3)中，采用薄层法进行点样和干燥，具体包括：
[0023]将TiO2/ZnAl
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LDO纳米材料基质溶液滴加到金属靶片上，待风干后，再滴加待测寡核苷酸溶液，继续风干后，获得点样后的靶板。
[0024]进一步优选，将TiO2/ZnAl
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LDO纳米材料滴加到MALDITOF MS的金属靶片上，待风干后，再滴加寡核苷酸溶液，继续风干后，进行MALDI
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TOFMS检测。
[0025]步骤3)中，所述的TiO2/ZnAl
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LDO纳米材料基质溶液中TiO2/ZnAl
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LDO纳米材料的浓度为0.5
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10mg/mL；
[0026]所述的待测寡核苷酸溶液中寡核苷酸浓度为0.5
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10nmol/μL(优选5nmol/μL)。
[0027]步骤4)中，所述的MALDI质谱分析采用的离子源检测模式为负离子模式。
[0028]步骤4)中，所述的MALDI质谱分析采用的离子检测器检测模式为反射模式或线性模式。
[0029]本专利技术提供了一种用于寡核苷酸的核苷酸序列进行测序的方法，所述方法包括以下步骤：
[0030]1、基质制备
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.TiO2/ZnAl
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LDO纳米材料作为MALDI基质对寡核苷酸测序中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述寡核苷酸长度在2
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30nt。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体包括：1)、基质制备：制备TiO2/ZnAl
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LDO纳米材料，通过溶解基质的溶剂配制TiO2/ZnAl
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LDO纳米材料溶液；2)、样品制备：配制待测寡核苷酸的水溶液；3)、靶板点样：分别取等体积的待测寡核苷酸溶液和TiO2/ZnAl
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LDO纳米材料基质溶液，采用薄层法进行点样和干燥，获得点样后的靶板；4)、点样后的靶板送入MALDI质谱仪，进行MALDI质谱分析。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1)中，制备TiO2/ZnAl
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LDO纳米材料，具体包括：1.1)将Zn(NO3)2·
6H2O和Al(NO3)3·
9H2O溶解在水中，超声使其充分溶解并记为A液；1.2)将Na2MoO4·
2H2O和NaOH溶于水中超声并作为B液；1.3)将A液和B液分别放入两个滴漏斗中，然后将其滴入20～30℃的包含TiO2的水中，同时控制滴速，使溶液的pH为8.5～9.5，滴完后，继续在20～30℃下...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘远江，周世文，冯鸿儒，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：