一种基于rac-2-Br-DMNPA的蛋白质固相化学连接方法技术

本发明专利技术提供了一种基于rac

【技术实现步骤摘要】
一种基于rac
‑2‑
Br
‑
DMNPA的蛋白质固相化学连接方法


[0001]本专利技术涉及多肽和/或蛋白质合成
，具体涉及一种基于rac
‑2‑
Br
‑
DMNPA的蛋白质固相化学连接方法

技术介绍

[0002]1963年Merrifield引入的固相多肽合成(SPPS)技术极大地促进了多肽和蛋白质的合成(R.B.Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,1963,85,14,2149
–
2154.)。SPPS策略简化了多肽合成过程中的纯化步骤，可通过添加过量的试剂来保证化学反应彻底进行，并且适用于多肽的自动化合成。但随着合成多肽序列长度的增加，在氨基酸数量达到50个以上时，通过SPPS获得完整肽段就会变得困难，而天然化学连接(NCL)的出现为在水相中合成多肽和蛋白质提供了新的策略。NCL通过可逆的硫酯化转移和不可逆的S
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N酰基转移反应，在两个连接肽段的N端和C端之间形成一个天然的肽键，连接无保护的多肽片段来得到全长蛋白，具有高度的化学选择性(T.Wieland,Liebigs Ann.Chem.,1953,583,129
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149.)。
[0003]为了获得大蛋白，更有效的多段NCL连接策略(C.Zuo,Org.Biomol.Chem.,2019,17,727
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744.)和用于一锅法的新型巯基保护基团及其脱保护策略(S.K.Maity,Angew.Chem.Int.Ed.,2016,55,8108
‑
8112.)逐步得到发展。但是，大型蛋白质的合成通常需要几个肽段的顺序组装，导致合成期间需要繁杂的纯化分离步骤，并且面对部分难溶的多肽或蛋白时，处理和纯化往往变得十分困难。
[0004]此外，一些巯基保护基团在SPPS时的早期引入是强制性的，这限制了它们在蛋白质合成中的广泛适用性。为了克服这个问题，利用对光不稳定的2
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硝基苯衍生物作为自由半胱氨酸巯基的后期按需保护的策略得到发展，但对其蛋白质化学合成中的应用还缺乏更深入的研究(R.K.McGinty,Nature,2008,453,812
‑
816.)。作为2
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硝基苯的衍生物，rac
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Br
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DMNPA是一种新型的双功能巯基后期保护基。在紫外光的照射下，可以实现巯基保护的快速脱除。采用rac
‑2‑
Br
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DMNPA作为巯基后期的正交保护基，能实现蛋白的一锅法连接、脱硫及脱Acm。但是在蛋白合成期间，仍难以避免多肽溶解性产生的不利影响以及脱保护后反应试剂的积累导致的液相纯化分离困难等问题。
[0005]因此，有必要开发一种合成简单、纯化便捷、产率可观、适用于半胱氨酸后期正交保护、能快速切割脱除的蛋白质固相连接方法，用以解决水溶性较差、难以分离的蛋白质的化学合成问题。

技术实现思路

[0006]为解决相关问题，本专利技术的首要目的在于提供一种基于rac
‑2‑
Br
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DMNPA的蛋白质固相化学连接方法。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供上述基于rac
‑2‑
Br
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DMNPA的蛋白质固相化学连接方法在多肽/蛋白质合成中的应用。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]一种基于rac
‑2‑
Br
‑
DMNPA的蛋白质固相化学连接方法，包括如下步骤：
[0010](1)SPCL树脂的制备：
[0011]采用Fmoc固相多肽合成法，以AM PEGA树脂为载体，从C端到N端依次缩合n个Fmoc
‑
Ala
‑
COOH，Fmoc
‑
(β)Ala
‑
OH，以及rac
‑2‑
Br
‑
DMNPA，洗涤，干燥，获得AM PEGA
‑
nAla
‑
(β)Ala
‑
rac
‑2‑
Br
‑
DMNPA树脂，简称SPCL(Solid phase chemical ligation)树脂；n为1
‑
4之间的整数；
[0012](2)根据目的多肽或蛋白的序列，从任意两个半胱氨酸划分为片段1、片段2、片段3，确保片段2和片段3的N端为半胱氨酸，同时片段2的中间段有至少一个半胱氨酸；
[0013](3)片段1、片段2、片段3的线性多肽树脂的制备：
[0014]使用C端为酰肼(
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NHNH2)末端的树脂，简称酰肼树脂，采用Fmoc固相多肽合成法，分别根据片段1、片段2、片段3的序列，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，洗涤，干燥，获得片段1、片段2、片段3的线性多肽树脂；其中，
[0015]片段2的N端的半胱氨酸侧链的巯基采用噻唑烷(Thz)作为保护基，其余半胱氨酸侧链的巯基采用乙酰胺甲基(Acm)或三苯甲基(Trt)作为保护基；
[0016](4)C端为酰肼的多肽片段2、多肽片段3的制备：
[0017]取步骤(3)制备得到的片段2、片段3的线性多肽树脂，加入切割试剂，使多肽链从酰肼树脂上脱下，并脱除剩余侧链保护基；经过滤、旋干、萃取、离心、冻干，得到C端为酰肼的片段2、片段3粗品；进一步分离纯化，冻干，得到C端为酰肼的多肽片段2、多肽片段3；
[0018](5)C端为MPAA的多肽片段1的制备：
[0019]取步骤(3)制备得到的片段1的线性多肽树脂，加入切割试剂，使多肽链从酰肼树脂上脱下，并脱除剩余侧链保护基；经过滤、旋干、萃取、离心、冻干，得到C端为酰肼的片段1粗品；溶解，加入乙酰丙酮，摇匀，再加入MPAA(4
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巯基苯基乙酸)，第一步反应，加入TCEP(三(2
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羧乙基)膦)，第二步反应，离心，过滤，进一步分离纯化，冻干，得到C端为MPAA的多肽片段1；
[0020](6)负载多肽片段2的SPCL树脂的制备：
[0021]取步骤(4)制备得到的C端为酰肼的片段2，溶解，加入步骤(1)制备得到的SPCL树脂，第一步反应，洗涤，重复第一步反应，洗涤，加入2
‑
巯基乙醇，第三步反应，洗涤，得到负载多肽片段2的SPCL树脂；
[0022](7)负载C端为MPAA的多肽片段2的SPCL树脂的制备：
[0023]乙酰丙酮和MPAA溶于缓冲盐溶液，与步骤(6)制备得到的负载多肽片段2的SPCL树脂混合，反应，洗涤，得到负载C端为MPAA的多肽片段2的SPCL树脂；
[0024](8)负载连接肽1的SPCL树脂的制备：
[0025]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于rac
‑2‑
Br
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DMNPA的蛋白质固相化学连接方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)SPCL树脂的制备：采用Fmoc固相多肽合成法，以AM PEGA树脂为载体，从C端到N端依次缩合n个Fmoc
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Ala
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COOH，Fmoc
‑
(β)Ala
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OH，以及rac
‑2‑
Br
‑
DMNPA，洗涤，干燥，获得AM PEGA
‑
nAla
‑
(β)Ala
‑
rac
‑2‑
Br
‑
DMNPA树脂，简称SPCL树脂；n为1
‑
4之间的整数；(2)根据目的多肽或蛋白的序列，从任意两个半胱氨酸划分为片段1、片段2、片段3，确保片段2和片段3的N端为半胱氨酸，同时片段2的中间段有至少一个半胱氨酸；(3)片段1、片段2、片段3的线性多肽树脂的制备：使用C端为酰肼末端的树脂，简称酰肼树脂，采用Fmoc固相多肽合成法，分别根据片段1、片段2、片段3的序列，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，洗涤，干燥，获得片段1、片段2、片段3的线性多肽树脂；其中，片段2的N端的半胱氨酸侧链的巯基采用噻唑烷作为保护基，其余半胱氨酸侧链的巯基采用乙酰胺甲基或三苯甲基作为保护基；(4)C端为酰肼的多肽片段2、多肽片段3的制备：取步骤(3)制备得到的片段2、片段3的线性多肽树脂，加入切割试剂，使多肽链从酰肼树脂上脱下，并脱除剩余侧链保护基；经过滤、旋干、萃取、离心、冻干，得到C端为酰肼的片段2、片段3粗品；进一步分离纯化，冻干，得到C端为酰肼的多肽片段2、多肽片段3；(5)C端为MPAA的多肽片段1的制备：取步骤(3)制备得到的片段1的线性多肽树脂，加入切割试剂，使多肽链从酰肼树脂上脱下，并脱除剩余侧链保护基；经过滤、旋干、萃取、离心、冻干，得到C端为酰肼的片段1粗品；溶解，加入乙酰丙酮，摇匀，再加入MPAA，第一步反应，加入TCEP，第二步反应，离心，过滤，进一步分离纯化，冻干，得到C端为MPAA的多肽片段1；(6)负载多肽片段2的SPCL树脂的制备：取步骤(4)制备得到的C端为酰肼的片段2，溶解，加入步骤(1)制备得到的SPCL树脂，第一步反应，洗涤，重复第一步反应，洗涤，加入2
‑
巯基乙醇，第三步反应，洗涤，得到负载多肽片段2的SPCL树脂；(7)负载C端为MPAA的多肽片段2的SPCL树脂的制备：乙酰丙酮和MPAA溶于缓冲盐溶液，与步骤(6)制备得到的负载多肽片段2的SPCL树脂混合，反应，洗涤，得到负载C端为MPAA的多肽片段2的SPCL树脂；(8)负载连接肽1的SPCL树脂的制备：取步骤(4)制备得到的多肽片段3，溶解，和步骤(7)制备得到的负载C端为MPAA的多肽片段2的SPCL树脂混合，进行自然化学连接反应，洗涤，得到负载连接肽1的SPCL树脂；(9)负载N端为游离半胱氨酸的连接肽1的SPCL树脂的制备：哌啶溶于缓冲盐溶液，得混合液1，取步骤(8)制备得到的负载连接肽1的SPCL树脂，加入混合液1，第一步反应，洗涤；甲氧胺盐酸盐、TCEP、盐酸胍溶于缓冲盐溶液，得混合液2，加入反应体系，第二步反应，洗涤，得到负载N端为游离半胱氨酸的连接肽1的SPCL树脂；(10)负载连接肽2的SPCL树脂的制备：取步骤(5)制备得到的C端为MPAA的片段1，溶解，和步骤(9)制备得到的负载N端为游离半胱氨酸的连接肽1的SPCL树脂混合，进行自然化学连接反应，洗涤，得到负载连接肽2的
SPCL树脂；(11)负载连接肽2的SPCL树脂的紫外光解：取步骤(10)制备得到的负载连接肽2的SPCL树脂，加入预先配置的光解溶液，通过紫外光光照，使连接肽2从SPCL树脂上脱下，离心，过滤，进一步分离纯化，冻干，得到目的多肽或蛋白。2.根据权利要求1所述的基于rac
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Br
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DMNPA的蛋白质固相化学连接方法，其特征在于：步骤(5)中溶解片段1粗品的溶液为5.5～6.5mol/L盐酸胍，0.15～0.25mol/L磷酸二氢钠，溶液的pH值为3.0
±
0.5；步骤(5)中所述的乙酰丙酮的用量，按片段1粗品：乙酰丙酮＝1:2.5的摩尔比计算；步骤(5)中所述的MPAA的用量，按片段1粗品：MPAA＝1:10的摩尔比计算；步骤(5)中所述的TCEP的用量，优选按片段1粗品：TCEP＝1:10的摩尔比计算；步骤(6)中溶解片段2的溶液为5.5～6.5mol/L盐酸胍，0.15～0.25mol/L磷酸二氢钠，溶液的pH值为3.0
±
0.5；步骤(6)中所述的片段2的用量按1倍当量的SPCL树脂装载量计算；步骤(6)中所述的2
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巯基乙醇的用量，按片段2：2
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巯基乙醇＝1:20的摩尔比计算；步骤(7)中溶解乙酰丙酮和MPAA的溶液为5.5～6.5mol/L盐酸胍，0.15～0.25mol/L磷酸二氢钠，溶液的pH值为3.0
±
0.5；步骤(7)中所述的乙酰丙酮的用量，按片段2：乙酰丙酮＝1:2.5的摩尔比计算；步骤(7)中所述的MPAA的用量，按片段2：MPAA＝1:40的摩尔比计算。3.根据权利要求2所述的基于rac
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Br
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DMNPA的蛋白质固相化学连接方法，其特征在于：步骤(5)中溶解片段1粗品的溶液为6mol/L盐酸胍，0.2mol/L磷酸二氢钠，溶液的pH值为3.0；步骤(6)中溶解片段2的溶液为6mol/L盐酸胍，0.2mol/L磷酸二氢钠，溶液的pH值为3.0；步骤(7)中溶解乙酰丙酮和MPAA的溶液为6mol/L盐酸胍，0.2mol/L磷酸二氢钠，溶液的pH值为3.0。4.根据权利要求1所述的基于rac
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Br
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DMNPA的蛋白质固相化学连接方法，其特征在于：步骤(8)中溶解片段3的溶液为5.5～6.5mol/L盐酸胍，0.15～0.25mol/L磷酸二氢钠，0.15～0.25mol...

【专利技术属性】
技术研发人员：何春茂，陈俊朗，张玉奇，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：