基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法，该方法采用DIA蛋白质组学定量分析技术，对大熊猫初乳和成熟乳中蛋白进行定量和定性，将蛋白质水平在大熊猫初乳与成熟乳中具有明显差异的蛋白作为标记蛋白，从而根据标记蛋白判断其为初乳和成熟乳。本发明专利技术首次鉴定了大熊猫乳汁中的蛋白质，为筛选反映大熊猫初乳和成熟乳的标记蛋白提供了依据，而且可以依据蛋白质水平结果判定大熊猫初乳和成熟乳，提供了一种新的品质评价方法。提供了一种新的品质评价方法。提供了一种新的品质评价方法。

【技术实现步骤摘要】
基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法


[0001]本专利技术属于乳品质量检测
，具体涉及一种基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法。

技术介绍

[0002]大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)是我国特有的珍稀哺乳动物，出生时极不成熟，耳聋、失明、几乎赤裸，新生幼仔与母亲的体重比最小，约为1/1000，出生后需要充足的母乳和极高质量的营养供应。
[0003]大熊猫母乳的营养状况对其幼仔的生长发育至关重要。母乳可以为幼仔提供大量的蛋白质、氨基酸、脂肪酸和其他生物活性成分，这些成分与免疫系统相互作用，并对幼仔的健康状况产生终身影响。有研究认为，大熊猫从初乳到成熟乳的过渡时间约为30天。在许多物种中，初乳和成熟乳的营养成分差异已经明确。但是关于大熊猫初乳和成熟乳的详细营养成分的研究极其有限。且从未吃过大熊猫初乳的幼仔，其成活率非常低。
[0004]此外，值得注意的是，大熊猫乳汁极其珍贵。母亲的乳汁通常只够喂养一只幼仔，然而，随着人工授精的成功采用，大熊猫产下的双胞胎数量显著增加，但很少有双胞胎的大熊猫妈妈有能力同时喂养两只幼崽，且它们的乳汁量少很难同时满足两只幼崽的生长需求。在这种情况下，饲养员会用前期冷冻贮藏的大熊猫乳汁或人工乳喂养幼仔。因此，判定大熊猫乳汁为初乳或成熟乳对于圈养大熊猫的繁殖发育至关重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案由下述步骤组成：
[0007]1.采集大熊猫初乳样品与成熟乳样品，分别提取乳中的蛋白。
[0008]2.将步骤1提取的蛋白混合，进行肽段酶解，并以数据依赖性采集(DDA)模式质谱分析进行数据采集，构建谱图库。
[0009]3.将步骤1提取的蛋白分别进行肽段酶解，以数据非依赖性采集(DIA)模式质谱分析进行数据采集。
[0010]4.对步骤3中获得的数据采用步骤2构建的谱图库进行定性定量分析，以定性后的肽段在初乳样品与成熟乳样品中的相对定量值之比的对数值作为判断蛋白丰度水平变化的依据，该对数值大于1.5则为上调蛋白，该对数值小于2/3则为下调蛋白，该对数值处于1.5和2/3之间则该蛋白丰度在初乳和成熟乳样品中无显著变化。
[0011]5.将步骤4获得的初乳样品与成熟乳样品中上调蛋白和下调蛋白按对数值从大到小排序，分别取上调蛋白中前5％和下调蛋白中后5％的蛋白作为标记蛋白，如果标记蛋白包含正相关的标记蛋白：含肽酶S1结构域的蛋白质(ELANE)、排序nexin
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2蛋白、EF
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hand结构域蛋白、肽聚糖识别蛋白1，则说明待测大熊猫乳样品为初乳；如果标记蛋白包含负相关的标记蛋白：ATP
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柠檬酸裂解酶、ATP合酶亚基、谷氨酰胺合成酶、柠檬酸合成酶、40S核糖体
蛋白S25(RPS25)、延伸率Tu、含硫氧还蛋白结构域蛋白、含TGc结构域蛋白、Ribosomal_L18e/L15P结构域蛋白、Ethylmalonyl
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CoA脱羧酶1(ECHDC1)，则说明待大熊猫乳样品为成熟乳。
[0012]上述步骤1中，大熊猫初乳和成熟乳的采集要由专业饲养人员进行，采集后立即在
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76～
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80℃冰箱中冷冻保存。
[0013]上述步骤2中，优选将步骤1提取的蛋白等质量混合。
[0014]上述步骤2中，酶解后的肽段先在C18色谱柱上脱盐，然后使用Thermo Scientific
TM Pierce
TM
高pH值反相多肽分馏试剂盒分馏成10个馏分，每个馏分掺入iRT标准肽段溶液后，先采用纳升级高效液相色谱进行梯度在线色谱分离，色谱柱为C18色谱柱，流动相：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液，其中乙腈水溶液中乙腈体积浓度为84％；色谱柱以95％的A液平衡，流速为300nL/min，分离梯度如下：0～40分钟，B液线性梯度从8％～30％；40～50分钟，B液线性梯度从30％～100％；50～65分钟，B液维持100％；纳升级高效液相色谱分离后用Q
‑
Exactive HFX质谱仪进行DDA质谱分析，分析时长65分钟，检测模式正离子，一级质谱扫描范围300～1800m/z，质谱分辨率60000@m/z 200，自动增益控制目标3e6，最大注入时间为25ms；每次一级质谱全扫描后根据包含列表采集20个自动触发二级扫描，分离窗口1.6Th，质谱分辨率15000@m/z 200，自动增益控制目标5e4，最大注入时间为25ms，MS2激活类型HCD，归一化碰撞能量30eV。
[0015]上述步骤2中，以DDA模式采集的数据采用Spectronaut软件(Spectronaut
TM 14.4.200727.47784)进行数据处理，检索参数设置如下：酶为胰蛋白酶，最大漏裂数为1，固定修饰为碳酰胺甲基，动态修饰为氧化和乙酰基(蛋白质N端)。数据库检索鉴定到的蛋白必须通过设定的过滤参数FDR<1％。
[0016]上述步骤3中，酶解后的肽段掺入iRT标准肽段溶液后，采用纳升级高效液相色谱进行梯度在线色谱分离，色谱柱为C18色谱柱，流动相：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液，其中乙腈水溶液中乙腈体积浓度为84％；色谱柱以95％的A液平衡，流速为300nL/min，分离梯度如下：0～40分钟，B液线性梯度从8％～30％；40～50分钟，B液线性梯度从30％～100％；50～65分钟，B液维持100％；纳升级高效液相色谱分离后用Q
‑
Exactive HFX谱仪进行DIA质谱分析，检测模式正离子，一级质谱扫描范围350～1650m/z，质谱分辨率60000@m/z 200，自动增益控制的目标3e6，最大注入时间为50ms；二级质谱设置30个DIA采集窗口，质谱分辨率30000@m/z 200，自动增益控制的目标3e6，最大注入时间为自动，MS2激活类型HCD，归一化的碰撞能量30eV，光谱数据类型为轮廓。
[0017]上述步骤4中，以DIA模式采集的数据采用Spectronaut软件(SpectronautTM 14.4.200727.47784)进行数据处理，软件参数设置如下：保留时间预测类型设置为动态iRT，MS2水平校正设置为允许，交叉运行规范化设置为允许，所有结果必须通过设定的过滤参数FDR<1％。
[0018]本专利技术通过DIA蛋白质组学技术，对大熊猫初乳和成熟乳中蛋白进行定量和定性，并对上调蛋白和下调蛋白按对数值从大到小排序，分别选择上调蛋白中前5％和下调蛋白中后5％的蛋白作为标记蛋白，从而判断大熊猫初乳或成熟乳。与现有鉴定方法相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0019]1.本专利技术首次鉴定了大熊猫乳汁中的蛋白质，为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法，其特征在于由以下步骤组成：(1)采集大熊猫初乳样品与成熟乳样品，分别提取乳中的蛋白；(2)将步骤(1)提取的蛋白混合，进行肽段酶解，并以DDA模式质谱分析进行数据采集，构建谱图库；(3)将步骤(1)提取的蛋白分别进行肽段酶解，以DIA模式质谱分析进行数据采集；(4)对步骤(3)中获得的数据采用步骤(2)构建的谱图库进行定性定量分析，以定性后的肽段在初乳样品与成熟乳样品中的相对定量值之比的对数值作为判断蛋白丰度水平变化的依据，该对数值大于1.5则为上调蛋白，该对数值小于2/3则为下调蛋白，该对数值处于1.5和2/3之间则该蛋白丰度在初乳和成熟乳样品中无显著变化；(5)将步骤(4)获得的初乳样品与成熟乳样品中上调蛋白和下调蛋白按对数值从大到小排序，分别取上调蛋白中前5％和下调蛋白中后5％的蛋白作为标记蛋白，如果标记蛋白包含正相关的标记蛋白：含肽酶S1结构域的蛋白质、排序nexin
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2蛋白、EF
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hand结构域蛋白、肽聚糖识别蛋白1，则说明待测大熊猫乳样品为初乳；如果标记蛋白包含负相关的标记蛋白：ATP
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柠檬酸裂解酶、ATP合酶亚基、谷氨酰胺合成酶、柠檬酸合成酶、40S核糖体蛋白S25、延伸率Tu、含硫氧还蛋白结构域蛋白、含TGc结构域蛋白、Ribosomal_L18e/L15P结构域蛋白、Ethylmalonyl
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CoA脱羧酶1，则说明待大熊猫乳样品为成熟乳。2.根据权利要求1所述的基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法，其特征在于：步骤(1)中，大熊猫初乳和成熟乳的采集要由专业饲养人员进行，采集后立即在
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76～
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80℃冰箱中冷冻保存。3.根据权利要求1所述的基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法，其特征在于：步骤(2)中，将步骤(1)提取的蛋白等质量混合。4.根据权利要求1所述的基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法，其特征在于：步骤(2)中，酶解后的肽段先在C18色谱柱上脱盐，然后使用Thermo Scientific
TM
Pierce
TM
高pH值反相多肽分馏试剂盒分馏成10个馏分，每个馏分掺入iRT标准肽段溶液后，先采用纳升级高效液相色谱进行梯度在线色谱分离，色谱柱为C18色谱柱，流动相：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液，其中乙腈水溶液中乙腈体积浓度为84％；色谱柱以95％的A液平衡，流速为300n...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘永峰，鱼喆喆，雷颖虎，施琳，付尚辰，赵鹏鹏，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：