地龙溶栓活性标志肽及其在地龙溶栓活性测定中的应用制造技术

本发明专利技术公开了地龙溶栓活性标志肽及其在地龙溶栓活性测定中的应用，该地龙溶栓活性标志肽，包括：参环毛蚓溶栓活性标志肽1～11，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:11所示；沪地龙溶栓活性标志肽3、11，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11所示。本发明专利技术从参环毛蚓中筛选出11条溶栓活性标志肽，其含量与地龙的溶栓活性呈现较强正相关性，可用于参环毛蚓溶栓活性的测定；其中2条与沪地龙溶栓活性具有强相关性，可用于沪地龙溶栓活性的测定。定。定。

【技术实现步骤摘要】
地龙溶栓活性标志肽及其在地龙溶栓活性测定中的应用


[0001]本专利技术涉及中药分析检测
，尤其涉及地龙溶栓活性标志肽及其在地龙溶栓活性测定中的应用。

技术介绍

[0002]地龙是我国的一味传统中药，始记载于《神农本草经》，常用于治疗中风等心脑血管疾病。其功效是清热定惊、活血通络、平喘利尿。《中国药典》2020年版收载地龙来源为钜蚓科参环毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretimaguillelmi(Michaelsen)或栉盲环毛蚓PheretimapectiniferaMichaelsen的干燥体，前一种习称"广地龙"，后三种习称"沪地龙"，《中国药典》2020版第一部中共收载了含有地龙的成方制剂41个品种。其中发挥清热定惊作用的有3个，占总制剂的7.32％，发挥平喘利尿功效的3个(7.32％)，平肝潜阳，降低高血压的3个(7.32％)，其余32个主要应用地龙活血通络功效，占总制剂的78.04％，主要用于临床症见腿脚屈伸不利、手足拘挛、或者腰膝酸软，口唇色暗，舌质暗红或有瘀斑等有血瘀症状的患者，严重者出现半身不遂，偏身麻木，口舌歪斜，语言謇涩等中风症状。
[0003]地龙中含有丰富的蛋白质、多肽、氨基酸、核苷等，其中蚓激酶为其主要的溶栓活性物质，它是从蚯蚓中提取的一类具有纤溶活性的激酶，又被称为蚯蚓纤溶酶(Earthworm fibrinolytic enzyme，EFE)。蚓激酶标准品是从赤子爱胜蚓Eisenia foetida中分离得到到一组酶，目前地龙溶栓活性测定一般以蚓激酶标准品为对照，采用琼脂糖纤维蛋白酶原平板法，通过测量溶圈的直径来确定纤溶活力。该方法为测定一类蚓激酶的总体活性，方法专属性、线性和稳定性均较差。
[0004]近年来，基于蛋白质组学研究，建立以特征肽为指标的质控方法为动物类中药质控标准的提升打开了新的局面。专利CN111303263A报道了5个特征多肽用于地龙常见品种参环毛蚓、通俗环毛蚓和保宁腔蚓的种属的鉴别。申请人所在课题组前期对地龙种属间蛋白质组差异进行研究，筛选出6个离子对用于鉴别药用地龙药材的真伪辨别，能够准确区分参环毛蚓、通俗环毛蚓和栉盲环毛蚓，并能鉴定出地龙常见伪品保宁环毛蚓、直隶腔蚓等。(Gu,Y.,Zhang,J.,Sun,J.,Yu,H.,Feng,R.,Mao,X.,Yang,X.,Zhou,Y.,Hu,Q.,Ji,S.Marker peptide screening and species
‑
specific authentication of Pheretima using proteomics.Anal.Bioanal.Chem.[J].2021；413(12):3167
‑
3176.)。
[0005]但是，目前特征肽鉴别方法只能用于地龙种属鉴别，不能检测药材的活性。市场上地龙药材溶栓活性参差不齐，甚至没有活性，因此，筛选出一组可以准确反映地龙溶栓活性的标志肽并建立活性测定方法，对于地龙药材的质量控制、规范地龙药材市场、保证临床用药安全具有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供地龙溶栓活性标志肽及其在地龙溶
栓活性测定中的应用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：
[0008]本专利技术第一方面提供一组地龙溶栓活性标志肽，包括
[0009]参环毛蚓溶栓活性标志肽1～11，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:11所示；
[0010]沪地龙溶栓活性标志肽3、11，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11所示。
[0011]进一步地，所述沪地龙为通俗环毛蚓和威廉环毛蚓。
[0012]进一步地，所述溶栓活性标志肽1～11的质谱条件为：
[0013][0014][0015]本专利技术第二方面是提供上述地龙溶栓活性标志肽在地龙溶栓活性测定中的应用。
[0016]本专利技术第三方面是提供基于上述地龙溶栓活性标志肽的地龙溶栓活性测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0017]步骤一，对待测样品进处理，得到待测多肽混合液；
[0018]步骤二，采用超高效液相色谱
‑
三重四级杆质谱仪检测所述待测多肽混合液，得到待测样品的溶栓活性标志肽质谱谱图。
[0019]进一步地，所述超高效液相色谱
‑
三重四级杆质谱仪检测的色谱条件为：
[0020]分析柱：CORTECS C18色谱柱，2.7μm 2.1
×
50mm；
[0021]进样量：1μl；
[0022]流速：0.2ml/min；
[0023]流动相：流动相A为0.1％甲酸
‑
水溶液，流动相B为乙腈，
[0024]梯度洗脱：0～10min，2～35％B；30～32min，35～90％B。
[0025]进一步地，所述超高效液相色谱
‑
三重四级杆质谱仪检测的质谱条件为：喷雾电压为4000V，气体温度270℃，流速16L/min，Nebulizer 45psi，采用MRM模式。
[0026]本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0027]本专利技术以地龙鲜品为研究对象，开展地龙组织与体腔液非标记蛋白质组学研究和地龙干燥温度的TMT标记蛋白质组学研究，通过系统比较上调和下调相关蛋白和多肽的变化，筛选出了11个与溶栓活性相关的标志肽，其含量与活性测定结果具有较强的正相关性。
[0028]本专利技术从参环毛蚓中筛选出11条溶栓活性标志肽，其含量与地龙的溶栓活性呈现较强正相关性，可用于参环毛蚓溶栓活性的测定；其中2条与沪地龙溶栓活性具有强相关性，可用于沪地龙溶栓活性的测定。
附图说明
[0029]图1是纤溶酶谱表征地龙组织与体腔液纤溶活性；
[0030]图2是不同干燥温度对地龙纤溶活性蛋白的影响；
[0031]图3是不同干燥温度样品鉴定非冗余肽Heatmap分析；
[0032]图4是参环毛蚓溶栓活性标志肽DMRM色谱图；
[0033]图5是参环毛蚓溶栓活性标志肽DMRM色谱图
‑
续；
[0034]图6是栉盲环毛蚓溶栓活性标志肽DMRM色谱图；
[0035]图7是通俗环毛蚓溶栓活性标志肽DMRM色谱图；
[0036]图8是溶栓活性标志肽专属性验证；
[0037]图9是广地龙药材标志肽含量与纤溶活力；
[0038]图10是沪地龙药材标志肽含量与纤溶活力Pearson相关性分析相关系数r值；
[0039]图11是沪地龙药材溶栓活性与标志肽含量；
[0040]图12是沪地龙药材标志肽含量与纤溶活力Pearson相关性分析相关系本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组地龙溶栓活性标志肽，其特征在于，包括参环毛蚓溶栓活性标志肽1～11，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:11所示；沪地龙溶栓活性标志肽3、11，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11所示。2.根据权利要求1所述的地龙溶栓活性标志肽，其特征在于，所述沪地龙为通俗环毛蚓和威廉环毛蚓。3.根据权利要求1所述的地龙溶栓活性标志肽，其特征在于，所述溶栓活性标志肽1～11的质谱条件为：4.权利要求1
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3任一项所述地龙溶栓活性标志肽在地龙溶栓活性测定中的应用。5.一种基于权利要求1
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3任一项所述地龙溶栓活性标志肽的地龙溶栓活性测定方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，对待测样品进行处理，得到待测多肽混合液；步骤二，采用超高效液相色谱
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三...

【专利技术属性】
技术研发人员：季申，张静娴，胡青，冯亭亭，毛秀红，孙健，于泓，冯睿，
申请(专利权)人：上海市食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：