一种自组装胶原蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及蛋白质加工工程技术领域，尤其是涉及一种自组装胶原蛋白及其制备方法和应用，其中，一种自组装胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：使用胃蛋白酶对动物源胶原蛋白进行消化处理，得到酶解消化液；将所述酶解消化液依次进行硅藻土吸附过滤、一次超滤透析、离子交换层析和二次超滤透析，得到纯化后的胶原蛋白溶液；将所述纯化后的胶原蛋白进行过滤灭菌，得到灭菌型胶原蛋白溶液；将所述灭菌型胶原蛋白溶液进行热冲击自组装，得到自组装胶原蛋白；优选地，所述热冲击自组装时，在1min内将自组装体系加热至35

【技术实现步骤摘要】
一种自组装胶原蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及蛋白质加工工程
，尤其是涉及一种自组装胶原蛋白及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是生命体内含量最丰富的蛋白质之一，其广泛存在于动物皮肤、骨骼和跟腱等组织中。由于天然胶原蛋白具有优异的生物相容性、良好的生物降解性以及低免疫原性，因而在食品科学、医学美容、生物材料等领域得到广泛使用。
[0003]分子自组装是指分子在一定平衡条件下，通过非共价键的作用自发形成一种稳定的、精确的超分子聚集体或超分子结构的过程，是天然胶原蛋白的最重要分子行为特征之一。在体内，胶原蛋白首先通过分子间疏水作用、氢键、离子键等相互作用形成微纤维，微纤维再进一步聚集成胶原纤维，从而为皮肤、跟腱、瓣膜等组织提供强大的生物力学性能。在体外，具有三螺旋结构的胶原蛋白在理想的浓度、温度、pH等条件下也能自组装形成胶原纤维或胶原凝胶，且经过自组装所形成的产物在机械性能、热稳定性和生物学性能都有显著提升。因此，自组装胶原蛋白在食品工业、生物医药材料以及化妆品等领域有着广泛的应用。然而，因其应用领域的不同，对其性能也提出了差异化的需求。在此背景下，实现胶原自组装分子行为调控并进而调节自组装产物性能也成为本技术亟需解决的一项技术问题。
[0004]胶原蛋白填充剂虽已经上市多年，但是目前产品的控制参数主要体现在胶原蛋白的浓度上，常见的规格也仅有20、35和65mg/ml。然而，胶原蛋白填充剂在使用过程中，其他参数也会极大的影响产品的使用体验和使用效果，比如产品的动力黏度，产品的黏弹性等。而这些参数，并不是只受胶原蛋白的浓度影响，与胶原蛋白的存在状态，也就是胶原蛋白的自组装结果密切相关，例如胶原蛋白纤维的直径、长度和密度。而胶原蛋白纤维的性质对温度、磷酸根离子浓度、离子强度和胶原分子的结构特征等聚合反应条件高度敏感。
[0005]目前，关于自组装胶原蛋白以及胶原蛋白制剂均未形成常规标准化，缺乏对胶原蛋白自组装过程的精细调控，所获得的胶原蛋白存在收率波动大，性质差异显著的问题；并且，对于胶原蛋白填充剂等可植入生物材料，也未将胶原蛋白的聚合物和胶原纤维自组装特性作为其设计特征和治疗策略的一部分。
[0006]鉴于此，本专利技术对胶原蛋白自组装过程中控制工艺进行了改进，提出了一种新型的控制去端肽胶原蛋白自组装的方法以及通过自组装生产医美胶原蛋白填充剂的方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术的第一目的在于提供一种自组装胶原蛋白及其制备方法，通过对胶原蛋白自组装过程的精细调控，获得了收率稳定、均一化的自组装胶原蛋白；
[0008]本专利技术的第二目的在于提供一种胶原蛋白填充剂，通过有效地调控胶原蛋白自组装过程参数，获得了具有理想流变学参数的胶原蛋白产品。
[0009]本专利技术提供一种自组装胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0010]S1、使用胃蛋白酶对动物源胶原蛋白进行消化处理，得到酶解消化液；
[0011]S2、将所述酶解消化液依次进行硅藻土吸附过滤、一次超滤透析、离子交换层析和二次超滤透析，得到纯化后的胶原蛋白溶液；
[0012]S3、将所述纯化后的胶原蛋白进行过滤灭菌，得到灭菌型胶原蛋白溶液；
[0013]S4、将所述灭菌型胶原蛋白溶液进行热冲击自组装，得到自组装胶原蛋白；
[0014]优选地，所述热冲击自组装时，控制自组装体系中胶原蛋白的浓度为2.0
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2.2mg/mL，离子强度为0.1
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0.3mol/L，pH值为7.0
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8.0，并在1min内将自组装体系加热至35
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37℃，保温30
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60s后降至室温。
[0015]在本专利技术胶原蛋白的自组装方法中，首先，使用胃蛋白酶对动物源胶原蛋白进行消化处理，以获得去端肽的胶原蛋白，有效保持了胶原的结构和生物活性；然后，采用对酶解消化液依次进行硅藻土吸附过滤、一次超滤透析、离子交换层析和二次超滤透析的纯化方法，在不同体系下有效彻底地去除了酶解消化液中的杂蛋白，提高了胶原蛋白的纯度，保留了胶原蛋白良好的生物相容性，为胶原蛋白的自组装奠定了必要的浓度、纯度基础；最后，使用热冲击自组装方法对胶原蛋白自组装过程进行精细调控，通过短时控温加速了胶原蛋白自组装速度和程度，该方法所制得的胶原蛋白收率稳定、性质均一。
[0016]作为本技术方案优选地，步骤S1之前还包括预处理，所述预处理包括依次对牛皮进行酸浸、破碎和匀浆，其中，所述酸浸时，使用质量浓度为1
‑
10％的醋酸溶液对清洗、清理后的牛皮进行浸泡，并控制浸泡的温度为4
‑
25℃，时间为5
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10d，浸泡完成后，将牛皮搅碎成牛皮颗粒；所述匀浆时，向破碎后的牛皮颗粒中加入注射用水进行匀浆，匀浆后使用醋酸调节pH至2
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3，得到组织匀浆液；优选地，牛皮颗粒与注射用水的比例为1kg：(2
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10)L。
[0017]作为本技术方案优选地，步骤S1中，所述消化处理具体包括：向所述组织匀浆液中加入胃蛋白酶溶液进行消化，消化处理后进行灭酶，得到匀浆消化液；优选地，胃蛋白酶溶液采用0.4
‑
0.6M的醋酸作为溶剂，且胃蛋白酶溶液的酶活为1000
‑
9000IU/ml；优选地，胃蛋白酶溶液与组织匀浆液的体积比为(0.8
‑
1.2)：100；优选地，所述消化时，控制温度为4
‑
25℃，时间为7
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10d；优选地，所述灭酶时，使用8
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12M的氢氧化钠溶液将消化处理后的组织匀浆液的pH调至9
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10，静置过夜，灭酶，得到匀浆消化液。
[0018]本专利技术使用胃蛋白酶对牛皮的组织匀浆液进行消化处理，可有效去除胶原分子端肽区域肽链序列，得到去端肽的胶原蛋白，以保持胶原的结构和生物活性。研究表明，本专利技术通过胃蛋白酶制备去端肽胶原蛋白的方法，所制得去端肽胶原蛋白的纯度可达99.9％，有效去除了天然胶原蛋白的免疫原性。
[0019]作为本技术方案优选地，步骤S2中，本专利技术首先使用硅藻土对匀浆消化液进行吸附处理，以去除未被酶解的牛皮颗粒，降低后续纯化的负担，而所述硅藻土吸附过滤过程具体包括：将匀浆消化液按1:1的比例加入注射用水，使用盐酸调节pH至4，充分搅拌后，加入预处理后的硅藻土进行静置吸附1
‑
3h，收集上清液并使用板框过滤机进行过滤，得到吸附过滤液；优选地，每1L匀浆消化液需加入硅藻土的量为13
‑
17g；优选地，所述硅藻土的预处理方法为：将硅藻土使用8
‑
12mM的盐酸溶液浸泡2h以上，浸泡后采用注射用水清洗3次以上；
[0020]在硅藻土吸附过滤后，使用分子截留量为100
‑
200kD的超滤膜，在醋酸钠体系下去除体系中的杂蛋白，并对胶原蛋白溶液进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种自组装胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、使用胃蛋白酶对动物源胶原蛋白进行消化处理，得到酶解消化液；S2、将所述酶解消化液依次进行硅藻土吸附过滤、一次超滤透析、离子交换层析和二次超滤透析，得到纯化后的胶原蛋白溶液；S3、将所述纯化后的胶原蛋白进行过滤灭菌，得到灭菌型胶原蛋白溶液；S4、将所述灭菌型胶原蛋白溶液进行热冲击自组装，得到自组装胶原蛋白；优选地，所述热冲击自组装时，控制自组装体系中胶原蛋白的浓度为2.0
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2.2mg/mL，离子强度为0.1
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0.3mol/L，pH值为7.0
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8.0，并在1min内将自组装体系加热至35
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37℃，保温30
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60s后降至室温。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1之前还包括预处理，所述预处理包括依次对牛皮进行酸浸、破碎和匀浆，其中，所述酸浸时，使用质量浓度为1
‑
10％的醋酸溶液对清洗、清理后的牛皮进行浸泡，并控制浸泡的温度为4
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25℃，时间为5
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10d；所述匀浆时，向破碎后的牛皮颗粒中加入注射用水进行匀浆，匀浆后使用醋酸调节pH至2
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3，得到组织匀浆液；优选地，牛皮颗粒与注射用水的比例为1kg：(2
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10)L。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述消化处理包括：向所述组织匀浆液中加入胃蛋白酶溶液进行消化，消化处理后进行灭酶，得到匀浆消化液；优选地，胃蛋白酶溶液采用0.4
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0.6M的醋酸作为溶剂，且胃蛋白酶溶液的酶活为1000
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9000IU/ml；优选地，胃蛋白酶溶液与组织匀浆液的体积比为(0.8
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1.2)：100；优选地，所述消化时，控制温度为4
‑
25℃，时间为7
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10d；优选地，所述灭酶时，使用8
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12M的氢氧化钠溶液将消化处理后的组织匀浆液的pH调至9
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10，静置过夜，得到匀浆消化液。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述硅藻土吸附过滤包括：将匀浆消化液按1:1的比例加入注射用水，使用盐酸调节pH至4，充分搅拌后，加入预处理后的硅藻土进行静置吸附1
‑
3h，收集上清液并使用板框过滤机进行过滤，得到吸附过滤液；优选地，每1L匀浆消化液需加入硅藻土的量为13
‑
17g；优选地，所述硅藻土的预处理方法为：将硅藻土使用8
‑
12mM的盐酸溶液浸泡2h以上，浸泡后采用注射用水清洗3次以上；所述一次超滤透析包括：使用分子截留量为100
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200kD的超滤膜进行超滤透析，当吸附过滤液浓缩至初始体积的一半时，补加等体积的醋酸钠溶液，反复重复3次；优选地，所述醋酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈萱宜，李宏强，王瀚，孙淑娟，黄海军，宋宇春，李岩冬，
申请(专利权)人：斐缦长春医药生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：