一种去端肽胶原蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种去端肽胶原蛋白及其制备方法和应用。本发明专利技术的去端肽胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：S1：对牛真皮组织进行预处理，制得预处理牛真皮组织；S2：对预处理牛真皮组织进行匀浆，制得匀浆液；S3：向匀浆液中加入胃蛋白酶进行酶解，酶解后灭酶，制得提取液；S4：对提取液进行分离纯化，制得去端肽胶原蛋白。本发明专利技术的方法能够高效地去除牛皮胶原蛋白端肽，从而制得几乎无免疫原性的具有完整三螺旋结构和生物活性的去端肽胶原蛋白，去端肽胶原蛋白产品的收率高，内毒素含量低，产品质量稳定可靠，能够良好地应用于医美等行业。能够良好地应用于医美等行业。能够良好地应用于医美等行业。

【技术实现步骤摘要】
一种去端肽胶原蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及胶原蛋白
，尤其是涉及一种去端肽胶原蛋白及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，其分子结构是由3条α肽链互相缠绕而成的3股螺旋结构，每一条肽链都由Gly
‑
X
‑
Y氨基酸序列重复而成。胶原蛋白的Gly
‑
X
‑
Y重复序列两侧存在由C端、N端的2个前肽形成的非螺旋结构，即C端肽与N端肽，Ⅰ型胶原的免疫原性主要分布在分子链的端肽区域，可在胶原提取过程中通过水解去除，从而制备去端肽胶原蛋白，以降低其免疫原性。
[0003]目前，现有的酶切去端肽技术能够去除胶原蛋白的端肽，从而在一定程度上降低胶原蛋白的免疫原性。当胶原蛋白用于植入剂时，对其免疫原性的要求进一步提高，然而现有的去端肽技术存在端肽去除率不稳定以及无法同时保证端肽去除率及胶原蛋白收率等问题。此外，现有的胶原蛋白制备方法还存在无法将胶原蛋白中的内毒素降低至医药行业标准规定范围(0.5EU/mL以下)以及胶原蛋白冻干后的复溶问题。
[0004]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种去端肽胶原蛋白及其制备方法和应用，该方法能够高效地去除牛皮胶原蛋白端肽，从而制得几乎无免疫原性的具有完整三螺旋结构和生物活性的去端肽胶原蛋白，产品质量稳定可靠。
[0006]本专利技术提供一种去端肽胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：<br/>[0007]S1：对牛真皮组织进行预处理，制得预处理牛真皮组织；
[0008]S2：对预处理牛真皮组织进行匀浆，制得匀浆液；
[0009]S3：向匀浆液中加入胃蛋白酶进行酶解，酶解后灭酶，制得提取液；
[0010]S4：对提取液进行分离纯化，制得去端肽胶原蛋白。
[0011]专利技术人研究发现：采用现有酶切去端肽技术去端肽时，若反应不足会导致端肽去除不彻底，进而不利于降低胶原蛋白的免疫原性；若反应过度则会导致胶原蛋白进一步降解，进而使得胶原蛋白收率过低，因此无法同时保证端肽的去除率和胶原蛋白的收率。即便通过工艺优化来控制某一批次的端肽去除率和胶原蛋白收率，然而却无法保证各批次产品端肽去除率和胶原蛋白收率保持稳定，产品存在质量不稳定等问题，进而无法保证各批次产品的质量稳定性和产品安全性。
[0012]本专利技术通过酶解时检测酶解液在波长520
‑
540nm下(例如波长527nm下)的吸光度，并在吸光度达到0.400
‑
0.450时进行灭酶，能够在保证端肽彻底去除的前提下，最大限度地提高胶原蛋白的收率，各批次产品的端肽去除率和胶原蛋白收率相对稳定，保证了产品的质量安全，能够良好地达到医疗级组织工程的材料相关要求。
[0013]在本专利技术步骤S1中，预处理可以包括：采用6
‑
10wt％的冰醋酸溶液对牛真皮组织进行第一次浸泡，第一次浸泡后对牛真皮组织进行搅碎，制得牛皮组织颗粒；其中，第一次浸泡温度为10
‑
25℃，第一次浸泡时间为7
‑
10d，对第一次浸泡时冰醋酸溶液的用量不作严格限制，只要能够浸没牛真皮组织即可。
[0014]进一步地，预处理还可以包括：采用0.5
‑
2.5wt％的氢氧化钠溶液对牛皮组织颗粒进行第二次浸泡，第二次浸泡后离心，随后采用注射用水进行洗涤，洗涤后离心并冷冻备用；其中，第二次浸泡温度为18
‑
25℃，第二次浸泡时间为2
‑
4h；对第二次浸泡时氢氧化钠溶液的用量不作严格限制，只要能够浸没牛皮组织颗粒即可；洗涤时注射用水的体积用量可以是牛皮组织颗粒质量的8
‑
10倍；此外，对冷冻备用时的冷冻温度不作严格限制，例如可以为
‑
20℃。预处理时采用氢氧化钠溶液进行浸泡主要用于去除内毒素，从而防止产品内毒素超标。
[0015]此外，预处理还可以包括：向牛皮组织颗粒中加入27
‑
28℃的注射用水进行融化；其中，注射用水的体积用量为牛真皮组织质量的7
‑
9倍。对融化时间不作严格限制，可以融化至牛皮组织颗粒全部达到融化状态即可。
[0016]在上述步骤S2中，匀浆可以包括第一匀浆和第二匀浆；其中，第一匀浆时的转速为17000
‑
19000rpm，匀浆时间为20
‑
40s，第二匀浆时的转速为20000
‑
21000rpm，匀浆时间为20
‑
40s。此外，匀浆液中牛真皮组织的含量可以控制在20
‑
30g/L。此外，匀浆时可以加入黄原胶进行保护，预处理牛真皮组织与黄原胶的重量比可以为1：(0.01
‑
0.02)。
[0017]在上述步骤S3中，酶解时可以控制胃蛋白酶的浓度为70
‑
90IU/mL匀浆液，采用冰醋酸控制pH值为2
‑
3，酶解温度为20
‑
22℃；酶解终点采用浸入式光谱吸光度测量法确定，检测波长例如为527nm，以酶解前的空白酶解液标记吸光度0点，酶解时在线吸光度检测数值在0.400
‑
0.450的范围时，结束酶解进入灭酶工序。
[0018]此外，灭酶可以包括：采用8
‑
12M的NaOH溶液将酶解后的酶解液的pH值调节至9
‑
9.5，随后在20
‑
22℃的条件下处理10
‑
15h。
[0019]本专利技术对提取液的分离纯化方式不作严格限制；具体地，步骤S4中，分离纯化包括：对提取液进行吸附过滤、浓缩换液、离子交换层析、二次浓缩换液、过滤除菌、离心精制。
[0020]具体地，吸附过滤可以包括：将提取液的pH值调节至3.9
‑
4.1，随后加入预处理硅藻土和半乳糖醛酸进行静置吸附，收集上清液并过滤，得到吸附过滤液；其中，预处理硅藻土的制备方法包括：采用8
‑
12mM的盐酸溶液将硅藻土浸泡2h以上，浸泡后采用纯化水清洗3次以上，得到预处理硅藻土；预处理硅藻土的加入量为14
‑
16g/L匀浆消化液，半乳糖醛酸的加入量为1
‑
2g/L匀浆消化液，静置吸附时间为1
‑
3h。
[0021]浓缩换液和二次浓缩换液分别包括：采用100kD的超滤膜，使用pH 4
‑
5的醋酸缓冲液换液1
‑
3次，换液后浓缩收液。
[0022]离子交换层析包括：在层析柱中装入阳离子交换树脂，采用10
‑
20mM的醋酸缓冲液冲洗平衡后上样，上样后使用10
‑
20mM的醋酸缓冲液冲洗杂蛋白，再用含有100
‑
200mM氯化钠的10
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种去端肽胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：对牛真皮组织进行预处理，制得预处理牛真皮组织；S2：对预处理牛真皮组织进行匀浆，制得匀浆液；S3：向匀浆液中加入胃蛋白酶进行酶解，酶解后灭酶，制得提取液；S4：对提取液进行分离纯化，制得去端肽胶原蛋白；优选地，酶解时检测酶解液在波长520
‑
540nm下的吸光度，并在吸光度达到0.400
‑
0.450时进行灭酶。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，预处理包括：采用6
‑
10wt％的冰醋酸溶液对牛真皮组织进行第一次浸泡，第一次浸泡后对牛真皮组织进行搅碎，制得牛皮组织颗粒；其中，第一次浸泡温度为10
‑
25℃，第一次浸泡时间为7
‑
10d。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，预处理还包括：采用0.5
‑
2.5wt％的氢氧化钠溶液对牛皮组织颗粒进行第二次浸泡，第二次浸泡后离心，随后采用注射用水进行洗涤，洗涤后离心并冷冻备用；其中，第二次浸泡温度为18
‑
25℃，第二次浸泡时间为2
‑
4h；优选地，预处理还包括：向冷冻备用的牛皮组织颗粒中加入27
‑
28℃的注射用水进行融化。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，匀浆包括第一匀浆和第二匀浆；其中，第一匀浆时的转速为17000
‑
19000rpm，匀浆时间为20
‑
40s，第二匀浆时的转速为20000
‑
21000rpm，匀浆时间为20
‑
40s。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，酶解时控制胃蛋白酶的浓度为70
‑
90IU/mL匀浆液，采用冰醋酸控制pH值为2
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3，酶解温度为20
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22℃；灭酶包括：采用8
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12M的NaOH溶液将酶解后的酶解液的pH值调节至...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈萱宜，李宏强，王瀚，孙淑娟，黄海军，宋宇春，李岩冬，
申请(专利权)人：斐缦长春医药生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：