本发明专利技术涉及到一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽及其规模化制备方法。不同于以往的海马专利文献报道中普遍采用的以海马为原料直接进行生物酶解的方法，本发明专利技术先从灰海马众多的蛋白中，筛选出抗氧化活性最强的灰海马酶溶性胶原蛋白(PSC)作为酶解的母体，再进行生物酶解与活性筛选，最终获得蛋白来源明确和功能活性显著的灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽；由此解决了海马多肽的蛋白来源不清楚，质量控制困难、产品生物活性不稳定、制备工艺重现性不高的难题。艺重现性不高的难题。
【技术实现步骤摘要】
题。
[0006]本专利技术提供一种工艺流程简洁新颖、生产耗时少、生产效率高、蛋白来源明 确和功能活性显著的灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，以期解决海马 多肽长期存在的蛋白来源不清楚，质量控制困难、产品生物活性不稳定、制备工艺重现性不 高的难题，实现灰海马原料的高值化开发利用。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术的技术解决方案是：一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于，其步骤如下： (1)灰海马酶溶性胶原蛋白(PSC)提取与分离纯化将灰海马剪成0.2～0.5cm的小段，添加0.05～10mol/L的弱酸作为提取剂，灰海马与提 取剂的重量比为1:5～1:10，同时加入原料重量0.05％～5％的胃蛋白酶并进行2～4小时的匀 浆提取，匀浆速度为10000～28000转/分，伴随搅拌散热以维持提取温度为4～10℃；提取 液先进行冷冻离心过滤，离心上清液再通过膜分离工艺技术进行分离纯化。上清液先用孔径 为1～0.2μm的微滤膜去除肉眼未见的细微残渣或可能的热原，透过液再用相对分子量为 150kDa～100kDa的超滤膜去除残余的胃蛋白酶、小分子杂质和无机盐，浓缩得到灰海马酶溶 性胶原蛋白溶液；(2)灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的生物酶解与分离纯化将灰海马酶溶性胶原蛋白溶液投入反应釜中，加入灰海马重量0.005％～0.020％的木瓜蛋 白酶或胰蛋白酶，加入碱溶液调节pH值6.5～8.5之间，反应温度为37～55℃，反应时间为 30～60分钟。酶解液也是通过膜分离工艺技术进行分离纯化。酶解液先用相对分子质量为 10kDa～5kDa的纳滤膜去除残余的蛋白酶和大分子杂质，所得清液再用相对分子质量为 500Da～200Da的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，并进一步浓缩得到含量≥95％的灰海马抗 氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽溶液；(3)冷冻干燥冷冻干燥灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽溶液，得到灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原 蛋白肽固体成品。
[0010]所述步骤(1)所使用的弱酸为醋酸、柠檬酸、草酸或苹果酸。
[0011]所述步骤(1)所使用的离心机为6000～15000rpm的高速冷冻离心机，离心 20～30分钟。
[0012]所述步骤(1)分离纯化步骤所使用的孔径为1～0.2μm的微滤膜流速为100～ 2000立方米/(小时
×
平方米)，膜压力为0.1～0.6Mpa，温度为0～10℃；所使用的相对分 子量为150kDa～100kDa的超滤膜流速为100～1200立方米/(小时
×
平方米)，膜压力为0.1～ 0.6Mpa，温度为0～10℃。
[0013]所述步骤(2)所使用的碱为氢氧化钠或氢氧化钾。
[0014]所述步骤(2)所使用的相对分子质量为10kDa～5kDa的纳滤膜流速为5～ 14立方米/小时，膜压力为0.5～1.0Mpa，温度为20～50℃；所使用的相对分子质量为500Da～ 200Da的纳滤膜流速为5～14立方米/小时，膜压力为0.5～4.5Mpa，温度为20～50℃。
[0015]所述步骤(3)中所使用的冷冻干燥的隔板温度为
‑
10～
‑
20℃、真空度为 13.33Pa、冻干时间为12～36小时。
[0013]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0014]1.本专利技术工艺的思路新颖、条理明确，不同于以往的海马专利文献报道中普 遍采用的以海马为原料直接进行生物酶解的方法，而是先从灰海马众多的蛋白中，筛选出抗 氧化活性最强的灰海马酶溶性胶原蛋白(PSC)作为酶解的母体，再进行生物酶解，获得蛋白 来源明确的灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽。由此不仅解决了海马多肽的蛋白来源不清 楚，质量控制困难、产品生物活性不稳定、制备工艺重现性不高的难题；而且，由于本专利技术 首先制备出灰海马PSC，后续的生物酶解所需蛋白酶的用量极少(仅为灰海马重量的0.005％～ 0.020％)，所需的酶解时间也可以控制在1个小时以内(30～60分钟)，因此，本专利技术可以极 大地减少试剂成本和时间投入。
[0015]2.本专利技术生产的灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽(灰海马PSC胰蛋白酶 酶解产物(样品编号：I，1号样品组)和灰海马PSC木瓜蛋白酶酶解产物(样品编号：N，2 号样品组))功能活性显著：其在体外抗氧化活性检测方面(FRAP法、ABTS法和Fenton法)， 明显优于其他灰海马PSC经过不同酶解方法得到的酶解产物；而且其在体内抗氧化实验的两 项指标(血清SOD活力和MDA含量)方面，也表现出显著的升高抗氧化酶活力作用和降低脂 质过氧化作用；不仅如此，其在小鼠负重游泳实验结果阳性，且血清乳酸和尿素二项生化指 标也呈阳性，可判定其具有缓解体力疲劳功能的作用。因此，本专利技术生产的灰海马抗氧化抗 疲劳活性胶原蛋白肽有望作为临床营养品或蛋白营养补充剂直接食用；甚至具备开发成为缓 解人体疲劳的保健食品或抗氧化功能食品的巨大潜质。
附图说明
[0016]图1是本专利技术方法：一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方 法的工艺流程图。
[0017]图2是灰海马经过不同处理方法得到的产物的铁离子还原/抗氧化能力对比图 (n＝3)。
[0018]图3是灰海马PSC经过不同酶解方法得到的酶解产物的铁离子还原/抗氧化能 力对比图(n＝3)。
[0019]图4是灰海马经过不同处理方法得到的产物的ABTS抗氧化能力对比图(n＝3)。
[0020]图5是灰海马PSC经过不同酶解方法得到的酶解产物的ABTS抗氧化能力对比 图(n＝3)。
[0021]图6是灰海马经过不同处理方法得到的产物的抑制羟自由基能力对比图(n＝3)。
[0022]图7是灰海马PSC经过不同酶解方法得到的酶解产物的抑制羟自由基能力对比 图(n＝3)。
[0023]图8是灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物的凝胶色谱图。
[0024]图9是灰海马PSC木瓜蛋白酶酶解产物的凝胶色谱图。
[0025]图10是灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的体内抗氧化实验测定的小鼠血 清超氧化物歧化酶(SOD)活力结果(阴性对照组——去离子水；阳性对照组——红牛功能饮 料；1号样品组(低浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；1号样品组 (高浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：3mg/mL；2号样品组(低浓度)—— 灰海马PSC木瓜蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；2号样品组(高浓度)——灰海马PSC 木瓜蛋白酶酶解产物，浓度：3mg/mL)(*——P<0.05为显著相关；**——P<0.01为极显著相 关)(n＝
功能饮料；1号样品组(低浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg/mL；1号 样品组(高浓度)——灰海马PSC胰蛋白酶酶解产物，浓度：3mg/mL；2号样品组(低浓度) ——灰海马PSC木瓜蛋白酶酶解产物，浓度：0.3mg本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于，其步骤如下：(1)灰海马酶溶性胶原蛋白PSC提取与分离纯化将灰海马剪成0.2～0.5cm的小段，添加0.05～10mol/L的弱酸作为提取剂，灰海马与提取剂的重量比为1:5～1:10，同时加入原料重量0.05％～5％的胃蛋白酶并进行2～4小时的匀浆提取，匀浆速度为1000～28000转/分，伴随搅拌散热以维持提取温度为4～10℃；提取液先进行冷冻离心过滤，离心上清液再通过膜分离工艺技术进行分离纯化：上清液先用孔径为1～0.2μm的微滤膜去除肉眼未见的细微残渣或可能的热原，透过液再用相对分子量为150kDa～100kDa的超滤膜去除残余的胃蛋白酶、小分子杂质和无机盐，浓缩得到灰海马酶溶性胶原蛋白溶液；(2)灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的生物酶解与分离纯化将灰海马酶溶性胶原蛋白溶液投入反应釜中，加入灰海马重量0.005％～0.020％的木瓜蛋白酶或胰蛋白酶，加入碱溶液调节pH值6.5～8.5之间，反应温度为37～55℃，反应时间为30～60分钟；酶解液也是通过膜分离工艺技术进行分离纯化：酶解液先用相对分子质量为10kDa～5kDa的纳滤膜去除残余的蛋白酶和大分子杂质，所得清液再用相对分子质量为500Da～200Da的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，并进一步浓缩得到含量≥95％的灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽溶液；(3)冷冻干燥冷冻干燥灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽溶液，得到灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽固体成品。2.根据权利要求1所述一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于：步骤(1)中所使用的弱酸为醋酸、柠檬酸、草酸或苹果酸。3.根据权利要求1所述一种灰海马抗氧化抗疲劳活性胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述冷冻离心过滤步骤所使用的离心机为6000～...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈思谨，洪专，张怡评，陈伟珠，蔡兵，谢全灵，乐卿清，
申请(专利权)人：自然资源部第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：
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