一种重组胶原蛋白的工业化纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种重组胶原蛋白纯化的方法，属于大分子蛋白纯化领域。本发明专利技术按照如下步骤进行：中空微滤、超滤1、离子交换层析、超滤2。本发明专利技术提供了一种易于实现、制备工艺简单的重组胶原蛋白纯化方法，该方法采用中空微滤，超滤结合阳离子交换法，仅一步离子交换法便可得到高纯度重组胶原蛋白，经该方法制备的重组胶原蛋白与天然胶原活性相似，这对于日益发展的医疗器械、化妆品及食品领域来说，有更多的优秀材料可以选择，非常有益。同时，本方案中流动相采用低浓度无机盐，纯化成本大大降低，且步骤简洁，易于实施操作，适宜进行大规模生产。适宜进行大规模生产。

【技术实现步骤摘要】
一种重组胶原蛋白的工业化纯化方法


[0001]本专利技术涉及一种重组胶原蛋白的工业化纯化方法，属于大分子蛋白纯化领域。
技术背景
[0002]胶原蛋白是一种生物高分子，它广泛存在于动物结缔组织中，约占体内蛋白总量的25
‑
30％，是哺乳动物体内分布最广、质量分数最多的功能性蛋白，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复起着重要作用。胶原蛋白的一级结构与大多数蛋白质有着明显区别，即胶原域中有“甘氨酸
‑
脯氨酸
‑
羟脯氨酸”或“甘氨酸
‑
脯氨酸
‑
X”和“甘氨酸
‑
X
‑
Y”这样一些重读序列存在。其中甘氨酸几乎占了总氨基酸残基的1/3，即没隔两个其他氨基酸残基即会连接一个甘氨酸，因此可以表示为(Gly
‑
X
‑
Y)
n
，X位置常出现脯氨酸(约为20％
‑
30％)，Gly
‑
Pro
‑
Y这样的重复序列约占了三肽总和的1/3，胶原蛋白中缺乏色氨酸，芳香氨基酸和半胱氨酸的含量也比较少，但是含有较多的其他蛋白质中少见的羟脯氨酸和羟赖氨酸残基。胶原蛋白的二级结构为3条左手螺旋链相互缠绕成的右手螺旋结构，即超螺旋结构。胶原蛋白独特的三重螺旋结构使其分子结构非常稳定，并且赋予其的自身低免疫原性和良好的生物相容性。由于起良好的生物活性，生物相容性及生物降解性，它在生物医学、组织工程、食品和化妆品等领域都有着广泛的应用。
[0003]重组胶原蛋白在食品领域中的应用，主要包括一下几方面：作为功能性食品和保健品，经常食用胶原蛋白丰富的食品可增加皮肤组织细胞的储水能力，增加和维持肌肤良好的弹性，延缓肌体衰老；作为肉制品改良剂，提升肉类的嫩度，改善产品品质，提高蛋白质含量；作为食品包装材料，如人工肠衣等。
[0004]重组胶原蛋白在化妆品领域中的应用，胶原蛋白中含有大量羧基和羟基的氨基酸。如羟脯氨酸、羟赖氨酸以及甘氨酸等天然保湿因子，对皮肤具有很好的保湿效果。此外，胶原蛋白多肽与皮肤细胞的生长、分裂、增殖、迁移以及分化有关，可提供养分从而延缓皮肤衰老并且还具有促进皮肤的创面修复和抗辐射的作用，因而广泛用于化妆品领域。
[0005]重组胶原蛋白在生物医学领域中的应用，胶原蛋白具有低抗原性、生物可降解性、生物相容性和促进血小板凝聚等生物学特性，是非常重要的天然生物材料，重组人源Ⅰ型胶原蛋白制备成的海绵具有多孔微观结构和低炎症反应的特性，可被运用于细胞组织的再生。重组人源Ⅱ型胶原蛋白能刺激细胞外软骨基质的更新合成，被应用于软骨再生。此外，重组胶原蛋白还被应用于混合仿生学或互穿网络支架，如制备人工角膜等。
[0006]目前各领域所有胶原蛋白主要采用酸、碱水解法或酶解法从、骨等组织中动物皮、骨等组织中提取获得，但这些方法只去的胶原蛋白水溶性差，很难分离到纯的胶原蛋白，且在临床上容易造成致病污染和出现排异反应，使其在作为医药、生物医学材料或药物载体等方面的应用受到很大限制。鉴于其广阔的应用前景，特别是在医用材料、美容、保健品领域，对优质的胶原蛋白需求量很大，寻找新的方法制备胶原蛋白就显得十分重要了，利用基因工程技术重组表达人胶原蛋白陈哥日一个很有意义的研究方向。
[0007]采用分子生物学技术制备重组人胶原蛋白有代替传统提取方法的趋势，但由于产
量低、纯化分离耗资大，使其价格昂贵。胶原蛋白的国内外市场需求一直很大，尤其是高质量的胶原蛋白产品的市场正处于一个开端期，因此利用生物分离工程和提纯重组胶原蛋白将会是一种更安全更高效的选择。生物分离工程是生物化学工程的一个重要组成部分，是研究生物产品分离和提纯过程原理和方法的一门分支学科，是生物技术转化为生产力不可缺少的重要环节，也可称之为生物技术下游加工过程。
[0008]生物产品的分离纯化过程是生物工程的下游工程，研究和开发生物分离过程技术的重要性不亚于上有的生物发酵过程及酶反应过程。在生物产业中，下游分离提取的成本占到整个成本的60％以上，尤其是基因工程菌发酵产品的分离和提纯所占费用达到了85％左右。因此，生物分离过程工序繁琐、技术难度大、回收率低、重复性差等缺点成为制约生物产品工业化生产的“瓶颈”，因此研究和改进生物分离技术、降低成本、简化工序、提高回收率对于生物产业的发展具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0009]本文专利技术的目的就是提供一种高效便捷的可以工业化进行重组胶原蛋白纯化的方法。所述重组胶原蛋白于毕赤酵母(Pichiapastoris)中表达。
[0010]众所周知，大多数生物产品下游加工过程都需要经过多步分离纯化手段才能得到最终理想纯度的产品，过程中的每一步分离步骤都会带来一定的产品损失。所以为了提高总回收率，进行了两方面的工艺改进及创新，减少了分离步骤的同时提高各步骤的回收率。
[0011]为达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案来实现：
[0012]一种重组胶原蛋白的工业化纯化方法，主要包括以下步骤：
[0013](1)此重组胶原蛋白是分泌表达产物，采用离心的方法进行菌体与发酵液的分离，得到离心上清液。
[0014](2)将离心上清液过滤，得到过滤液。
[0015](3)将过滤液进行中空微滤，中空微滤完成后得到中空微滤透过液。
[0016](4)中空微滤透过液进行超滤1，超滤1完成后得到超滤脱盐浓缩液1。
[0017](5)超滤脱盐浓缩液1稀释后进行离子交换层析，得到洗脱液。
[0018](6)将洗脱液进行超滤2，超滤2完成后得到超滤脱盐浓缩液2。
[0019](7)超滤浓缩脱盐液2可直接进行冻干。
[0020]在步骤(1)中采用碟片式离心机能够按纯化要求进行固液分离，方便进行下游纯化规模放大，提高纯化过程中的离心效率，节约时间成本。
[0021]优选的，本专利技术的步骤(2)得到的过滤液中加入酸性氨基酸，加入酸性氨基酸的质量百分比为0.01
‑
0.02％。
[0022]加入酸性氨基酸，一是可以调节过滤液的pH，二是可以起到保护过滤液中的重组胶原蛋白的作用，防止蛋白质变性。
[0023]加入的酸性氨基酸最佳选择是谷氨酸。
[0024]优选的，调节过滤液pH值在4.5
‑
5。胶原蛋白的稳定和pH有很大关系，在本专利技术的纯化过程中，过滤液pH值在4.5
‑
5之间，最适合保持胶原蛋白的稳定。
[0025]进一步的，通过加入醋酸来调节过滤液pH。
[0026]在过滤液中加入的小分子成分，在后面的步骤中都可以通过超滤去除。
[0027]步骤(3)中的中空微滤能够除去部分分子量大于重组胶原蛋白分子量的杂蛋白。
[0028]步骤(4)中，超滤1能够除去部分分子量小于重组胶原蛋白分子量的杂蛋白。
[0029]步骤(5)中，离子交换层析本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组胶原蛋白的工业化纯化方法，其特征在于，以此按照如下步骤进行：中空微滤、超滤1、离子交换层析、超滤2。2.根据权利要求1所述的一种重组胶原蛋白的工业化纯化方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）采用离心的方法进行菌体与发酵液的分离，得到离心上清液；（2）将离心上清液过滤，得到过滤液；（3）将过滤液进行中空微滤，中空微滤完成后得到中空微滤透过液；（4）中空微滤透过液进行超滤1，超滤1完成后得到超滤脱盐浓缩液1；（5）超滤脱盐浓缩液1稀释后进行离子交换层析，得到洗脱液；（6）将洗脱液进行超滤2，超滤2完成后得到超滤脱盐浓缩液2；（7）超滤浓缩脱盐液2可直接进行冻干。3.根据权利要求2所述的一种重组胶原...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜寿俊，殷世清，罗伟鹏，赵婌言，张凤龙，马铭鸿，田寻，蔡永刚，
申请(专利权)人：山东柏佳薇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：