一种检测外膜囊泡的荧光探针及其应用制造技术

本发明专利技术属于检测技术领域，目的是开发一种能够用于OMV研究的荧光探针，本发明专利技术荧光探针采用具有下式生色团的化合物，并将其应用于OMV检测。这类材料在缓冲液中或者MOPS培养液中都不发射荧光或发射微弱荧光。在革兰氏阴性菌存在时，其发射荧光很弱或不发射荧光。当其结合到OMV后，荧光增强。有利于快速鉴定OMV的产生和确定诱导OMV产生的最适条件。对于研究OMV具有重要的意义。OMV具有重要的意义。OMV具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种检测外膜囊泡的荧光探针及其应用


[0001]本专利技术属于检测
，目的是开发一种能够用于OMV研究的荧光探针，本专利技术荧光探针采用具有下式生色团的化合物，并将其应用于OMV检测。

技术介绍

[0002]外膜囊泡(OMV)大多是由革兰氏阴性菌产生的球状凸起。OMV中负载了包括脂多糖，鞭毛蛋白，肽聚糖，酶，DNA，RNA等生物分子。这些生物分子使得OMV能够参与到很多重要的生物过程，包括细菌致病性，信息传递，群体感应，水平基因传递和对压力环境的反应。此外OMV在调控宿主的免疫中也有很重要的作用，因此可以通过调节OMV来诱导产生免疫，进而被应用于疫苗的助剂。OMV在开发癌症疫苗和癌症的免疫疗法中也具有很重要的意义。
[0003]OMV的尺寸在20
‑
250nm。如此小的尺寸使得实验中观察OMV非常的困难。
[0004]目前在OMV的研究中，通常采用蛋白质组学(1)和粒子追踪技术(2)。但是这两种技术需要冗长的差速离心或者超滤，使得OMV的研究非常困难(3
‑
5)。
[0005]荧光技术具有良好的灵敏性，但是目前大多数荧光在溶液态具有很强的荧光，因而在研究OMV的过程中产生很强的背景。这种强的背景使得对OMV的定量分析非常困难，也降低了分析的灵敏性。
[0006]参考文献：
[0007]1.W.Elhenawy，M.O.Debelyy，M.F.Feldman，mBio 2014，5，e00909
‑
00914.
[0008]2.M.J.H.Gerritzen，D.E.Martens，R.H.Wijffels，M.Stork，J.Extracell.Vesicles 2017，6，1333883.
[0009]3.R.Dehinwal，D.Cooley，A.V.Rakov，A.S.Alμgupalli，J.Harmon，O.Cunrath，P.Vallabhajosyula，D.Bμmann，D.M.Schifferli，mBio 2021，12，e0086921；
[0010]4.A.J.Manning，M.J.Kuehn，BMC Microbiol.2011，11，258；
[0011]5.A.Bauwens，L.Kunsmann，H.Karch，A.Mellmann，M.Bielaszewska，Antimcrob.Agents Chemother.2017，61，e00937
‑
00917.

技术实现思路

[0012]鉴于现有技术存在的问题，本专利技术的目的是开发一种能够用于OMV研究的荧光探针。该荧光探针具有低荧光背景，在结合OMV后其荧光增强，能够灵敏的检测OMV的生成，并对高通量的筛选能够诱导OMV产生的因素。
[0013]一种检测外膜囊泡的荧光探针，采用具有下式生色团的化合物，并将其应用于外膜囊泡(OMV)检测，
[0014][0015]其中A1，A2，A3，A4独立选自并且A1，A2，A3，A4中至少一个为至少一个为
[0016]其中A1，A2，A3，A4可以相同，也可以不同；
[0017]其中n在0
‑
100，优选1
‑
50，更优选1
‑
10；
[0018]R1，R2可以相同也可以不同，它们可以是任何阴离子，包括氟离子，氯离子，溴离子，碘离子，六氟磷酸根粒子，乙酸根离子等等。改变阴离子不影响本专利技术的保护内容。
[0019]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述化合物选自该化合物相对于其他可作为荧光探针的化合物具有低荧光背景，在结合OMV后其荧光增强，能够灵敏的检测OMV的生成。
[0020]作为本专利技术的一种优选技术方案，这些化合物溶液中荧光很弱，或者不发射荧光。
[0021]作为本专利技术的一种优选技术方案，这些化合物在缓冲液或MOPS培养液中不发光或者发出微弱的光。
[0022]作为本专利技术的一种优选技术方案，当用这些化合物在缓冲液或者MOPS培养液中对革兰氏阴性菌染色的时候，革兰氏阴性菌不发光或者发出很弱的光。
[0023]作为本专利技术的一种优选技术方案，当革兰氏阴性菌在刺激条件下，包括化学物质刺激，温度刺激，物理刺激等等，产生OMV时，用这些化合物孵育可以使得溶液的荧光增强。
[0024]作为本专利技术的一种优选技术方案，化学物质刺激包括抗生素刺激，包括但不限于氨苄霉素、卡纳霉素、氨曲南、氯霉素。
[0025]作为本专利技术的一种优选技术方案，这些化合物结合到OMV时，其荧光会增强。
[0026]作为本专利技术的一种优选技术方案，分泌OMV的革兰氏阴性菌也会被这些化合物结合，荧光增强。
[0027]作为本专利技术的一种优选技术方案，这些化合物使用的浓度范围在0.01微摩尔到10毫摩尔。优选0.1微摩尔到1毫摩尔。更优选1微摩尔到500微摩尔。
[0028]作为本专利技术的一种优选技术方案，对产生OMV的革兰氏阴性菌的种类没有限制。
[0029]作为本专利技术的一种优选技术方案，革兰氏阴性菌选自EcN(E.coli Nissle 1917)。
[0030]作为本专利技术的一种优选技术方案，由细菌产生OMV，细菌可以是革兰氏阳性菌，也可以是革兰氏阴性菌。
[0031]本专利技术相对于现有技术的有益效果包括：
[0032]本专利技术采用一类新型荧光材料检测OMV的存在。这类材料在缓冲液中或者MOPS培养液中都不发射荧光或发射微弱荧光。在革兰氏阴性菌存在时，其发射荧光很弱或不发射荧光。当其结合到OMV后，荧光增强。因而根据其荧光强度的变化可以检测OMV的产生，并高通量筛选能够诱导OMV产生的各种因素，包括不同种类/浓度的抗生素处理等。有利于快速鉴定OMV的产生和确定诱导OMV产生的最适条件。对于研究OMV具有重要的意义。
附图说明
[0033]图1.不同条件下OTM的荧光强度变化，图中OD
600
代表EcN(E.coli Nissle 1917)的浓度，其中：
[0034]1.EcN培养5小时后，在10μmol/L的OTM存在时的荧光照片；
[0035]2.EcN在1μg/mL的氨苄霉素条件下培养5小时后，在10μmol/L的OTM存在时的荧光照片；
[0036]3.EcN在1μg/mL的氨苄霉素条件下培养5小时后，去上清液，菌体部分重新分散后，在10μmol/L的化合物存在时的荧光照片；
[0037]4.EcN在1μg/mL的氨苄霉素条件下培养5小时后，上清液在10μmol/L的化合物存在时的荧光照片；
[0038]5.仅有氨苄霉素时，在10μmol/L的化合物存在时的荧光照片。实验表明，氨苄霉素诱导OMV产生，OMV在上清液中，上清液发射荧光。
[0039]图2.EcN在不同浓度的抗生素条件下培养5小时后，在10μmol/L的OTM存在时的相对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测外膜囊泡的荧光探针，其特征在于，采用具有下式生色团的化合物，并将其应用于外膜囊泡(OMV)检测，其中A1，A2，A3，A4独立选自并且A1，A2，A3，A4中至少一个为至少一个为其中A1，A2，A3，A4可以相同，也可以不同；其中n在0
‑
100，优选1
‑
50，更优选1
‑
10；R1，R2可以相同也可以不同，它们可以是任何阴离子，包括氟离子，氯离子，溴离子，碘离子，六氟磷酸根粒子，乙酸根离子等等。2.根据权利要求1所述的一种检测外膜囊泡的荧光探针，其特征在于，这些化合物在溶液中荧光很弱，或者不发射荧光。3.根据权利要求1所述的一种检测外膜囊泡的荧光探针，其特征在于，这些化合物在缓冲液或MOPS(3
‑
(N
‑
吗啉基)丙磺酸)培养液中不发光或者发出微弱的光。4.根据权利要求1所述的一种检测外膜囊泡的荧光探针，其特征在于，当用这些化合物在缓冲液或者MOPS培养液中对...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵恩贵，陈斯杰，辜美佳，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学深圳，
类型：发明
国别省市：