一种混检筛选高产菌株的方法技术

本发明专利技术公开了一种混检筛选高产菌株的方法，所述混检筛选方法包括，菌悬液经过诱变后加入菌种适宜浓度抗性物质，混合均匀后置于含培养基的容器中振荡培养，通过判断生长参数挑选适宜的菌群，选择菌群分离单菌落获得高产的纯化菌种。所述菌悬液为单细胞或单孢子菌悬液；所述诱变包括物理诱变、化学诱变、生物诱变的方法；所述抗性物质指能够杀死或抑制生产菌株的物质；所述适宜浓度指能够杀死或抑制生产菌株的浓度；所述菌群指生长参数满足筛选要求的菌体培养液，此方法提高菌种筛选效率，从而提高菌株目标产物的产量。本发明专利技术的方法适用于不同菌株或不同目的产物的菌种筛选。不同菌株或不同目的产物的菌种筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种混检筛选高产菌株的方法


[0001]本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种混检筛选高产菌株的方法。

技术介绍

[0002]菌种筛选是用不同的方法选出具有特殊性能的菌株，对于工业微生物而言，菌株筛选是提高菌株生产能力的重要途径之一，在发酵工业中占有重要地位，菌种筛选技术对于提高发酵产品的产量和质量，以及进一步开发利用微生物资源，增加发酵工业产品的品种，具有重大意义。
[0003]诱变育种是以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选产量高性状优良的变异突变株。诱变育种作为传统微生物育种方法，到目前仍作为重要的菌种筛选策略和手段，尤其现代发酵行业迅猛发展的今天，诱变育种同分子改造和高通量筛选等先进技术结合，获得很好的效果。传统的菌种筛选一般包括两个步骤，即初筛和复筛。初筛是去除明显不符合要求的大部分菌株，保留能力高或相近的菌株，复筛是确认符合生产要求的菌株。
[0004]常规的菌种筛选流程是出发菌株经过诱变后分离单菌落，对单菌落进行摇瓶或孔板等方式培养，进行产量评估后筛选高产菌株，这种方法具有工作量大，筛选效率低，漏筛几率高等问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种混检筛选高产菌株的方法，该方法筛选效率高，工作量小，提高了生产菌株的产量。
[0006]一种混检筛选高产菌株的方法，菌悬液经过诱变后加入抗性物质，混合均匀后置于含培养基的容器中振荡培养，通过检测不同容器中菌群生长参数，挑选适宜的菌群，菌群分离单菌落获得纯化的高产菌种。
[0007]本专利技术中，常规菌种筛选的基础上首先利用高通量方法筛选具有抗性物质的抗性菌株群，以菌种的生长情况初步判断菌株的抗性能力，所筛选的抗性菌株群进行发酵产能检验，筛选更佳的菌株群，然后对菌株群进行分离，用摇瓶或高通量等方法筛选高产菌株，同时对所筛选的菌株进行抗性能力验证。
[0008]优选的，菌悬液为单细胞或单孢子菌悬液，菌悬液单细胞或单孢子的浓度为107～108个/ml。
[0009]优选的，诱变包括物理诱变、化学诱变、生物诱变的方法。
[0010]优选的，所述抗性物质指能够杀死或抑制生产菌株的物质；进一步优选为目标产物，副产物，前体，前体结构类似物，底物，代谢中间体和抗生素中的一种或者多种。
[0011]优选的，所述抗性物质的浓度指能够杀死或抑制生产菌株物质的浓度；进一步优选为最低抑制浓度。
[0012]优选的，所述含培养基的容器指能够进行细胞培养的设备，进一步优选为摇瓶，试
管或孔板。
[0013]优选的，所述通过生长参数挑选适宜的菌群，所述参数进一步优选生长浊度和产物浓度。
[0014]优选的，所述通过混检筛选高产菌株的方法，经过分离纯化菌群，筛选获得高产菌株。
[0015]优选的，所筛选的纯化高产菌株，具有抗性物质特定浓度的抗性能力。
[0016]本专利技术的方法特别适合于多粘类芽孢杆菌的筛选，作为优选，所述的菌悬液中的菌株为多粘类芽孢杆菌；
[0017]所述的诱变为紫外光照射或/和EMS溶液处理；
[0018]所述的抗性物质为α
‑
氨基丁酸或/和链霉素，其中，α
‑
氨基丁酸为前体物质，链霉素为抗生素。
[0019]作为优选，所述的混检筛选高产菌株的方法，包括以下具体步骤：
[0020](1)将含多粘类芽孢杆菌的菌悬液用EMS溶液处理，接种于种子培养基，同时加入α
‑
氨基丁酸，分装于酶标板中，进行摇床振荡培养，然后用酶标仪检测菌种生长状态，筛选出未受到抑制的菌群1；
[0021](2)将步骤(1)得到的菌株1配制成菌悬液，然后采用紫外光进行照射，再接种于种子培养基，同时加入α
‑
氨基丁酸，分装于酶标板中，进行摇床振荡培养，然后用酶标仪检测菌种生长状态，筛选出未受到抑制的菌群2。
[0022](3)将步骤(2)得到的菌种2配制成菌悬液，依次用紫外光进行照射和EMS溶液处理，再接种于种子培养基，同时加入α
‑
氨基丁酸和链霉素，然后用酶标仪检测菌种生长状态，筛选出未受到抑制的菌群3；
[0023]所述菌群1、菌群2和菌群3通过分离发酵培养筛选得到所述的高产菌株
[0024]作为优选，步骤(1)～(3)中，所述的发酵培养筛选包括菌种效价的检测过程。
[0025]作为优选，所述的紫外光的功率为15～20W，照射时间为30～90s。
[0026]作为优选，所述EMS溶液的浓度为0.05～0.15mol/L。
[0027]作为优选，α
‑
氨基丁酸的终浓度为0.4～0.6％；
[0028]所述链霉素的浓度为80～100u/mL。
[0029]同现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：
[0030]采用本专利技术的方法，可提高菌种生产能力，本专利技术也可结合其他菌种筛选方法，达到更好的效果。本专利技术操作简便，有利于工业微生物的菌种筛选。
具体实施方式
[0031]下面对本专利技术的实施例对本专利技术进行描述，所描述的实施例仅仅为本专利技术的一部分。以下实施例以产多粘菌素E菌株多粘类芽孢杆菌为实验菌株，具体使用的菌种为多粘类芽孢杆菌CGMCC 1.541，为公众可获得的菌种，本专利技术的实例用于说明本专利技术，但不能用来限制本专利技术的范围，使用本专利技术的方法用于其他生产菌株也能得到相同的结论。
[0032]本专利技术中，如无特殊说明，实验方法为常规方法，所使用的实验材料为常规生化试剂。
[0033]本专利技术中，除非特殊说明，试管斜面培养基的制备方法为，试管斜面培养基成分
为：酵母抽提物0.4％，胰蛋白胨1.0％，氯化钠1.0％，琼脂粉 2.0％，余量为水，pH调至7.2，试管规格20mm*220mm，装量20ml，经 121℃灭菌30min。
[0034]本专利技术中，除非特殊说明，平板培养基的制备方法为，平板培养基成分为：酵母抽提物0.4％，胰蛋白胨1.0％，氯化钠1.0％，琼脂粉2.0％，余量为水，pH调至7.2，经121℃灭菌30min，分装至直径9cm的无菌平板，装量30ml。
[0035]本专利技术中，除非特殊说明，种子培养基的制备方法为，种子培养基成分：大豆蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.1％，余量的水，pH调节7.0，经121℃灭菌30min。
[0036]本专利技术中，除非特殊说明，发酵培养基的制备方法为，发酵培养基成分：玉米淀粉5％，黄豆饼粉2％，硫酸铵1％，磷酸氢二钾0.1％，余量的水，pH调节7.0，分装30ml每250ml三角摇瓶，经121℃灭菌30min。
[0037]实施例1
[0038]将多粘芽孢杆菌菌种CGMCC 1.541接到试管斜面培养基上，30℃静置培养1天，吸取10ml无菌水洗脱表面菌体，混匀后用含棉花的注射器无菌过滤得单细胞菌悬液。
[0039]将上述单细胞菌悬液置于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种混检筛选高产菌株的方法，其特征在于，包括：菌悬液经过诱变后加入抗性物质，混合均匀后置于含培养基的容器中振荡培养，通过检测不同容器中菌群生长参数，挑选适宜的菌群，菌群分离单菌落获得纯化的高产菌种。2.根据权利要求1所述的混检筛选高产菌株的方法，其特征在于，所述菌悬液是单细胞或单孢子菌悬液。3.根据权利要求1所述的混检筛选高产菌株的方法，其特征在于，所述诱变包括物理诱变、化学诱变、生物诱变的方法；所述抗性物质为目标产物，副产物，前体，前体结构类似物，底物，代谢中间体，抗生素中的一种或者多种。4.根据权利要求1所述的混检筛选高产菌株的方法，其特征在于，所述的菌悬液中的菌株为多粘类芽孢杆菌；所述的诱变为紫外光照射或/和EMS溶液处理；所述的抗性物质为α
‑
氨基丁酸或/和链霉素。5.根据权利要求4所述的混检筛选高产菌株的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：(1)将含多粘类芽孢杆菌的菌悬液用EMS溶液处理，接种于种子培养基，同时加入α
‑
氨基丁酸，分装于酶标板中，进行摇床振荡培养，然后用酶标仪检测菌种生长状态，筛选出未受到抑制的菌群1；(2)将步骤(1)得到的菌种1制备菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：何敏，孟荣，翟倩，麻荣军，陆凌霄，许丹英，吕立获，李兴武，胡佳鹏，
申请(专利权)人：浙江普洛生物科技有限公司普洛药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：