一种高水平发酵生产安普霉素的方法技术

本发明专利技术公开了一种高水平发酵生产安普霉素的方法，该方法包括：斜面种子、种子液培养、种子罐及发酵罐培养，操作简单，易于控制，可大幅提高安普霉素的发酵单位，由该方法制备的安普霉素，其生物效价单位可达12000U/ml。

【技术实现步骤摘要】
一种高水平发酵生产安普霉素的方法
本专利技术属于微生物工业发酵
，具体涉及一种能够有效提高安普霉素发酵单位的方法。
技术介绍
黑暗链霉菌合成的安普霉素是一种新型的广谱兽用抗生素，在80年代由美国礼来公司开发成产品，为国家2000年批准的二类新兽药，对革兰氏阴性菌和葡萄球菌有很高的抗菌活性。由于分子中具有独特的辛二糖结构异于其它氨基糖苷类抗生素，对多种氨基糖苷类抗生素的耐药菌有抑制和杀灭作用，使用中不易产生交叉耐药性，低毒、低残留量、安全的特点。对畜禽感染的革兰氏阴性菌有较强抗菌活性，特别是用于耐药强的大肠杆菌和沙门氏菌。作为药物饲料添加剂，也能明显促进增重和提高饲料转化率，被广泛应用于由大肠杆菌、沙门氏菌等引起的畜禽急慢性腹泻、肠炎等疾病的预防和治疗中。安普霉素由黑暗链霉菌发酵合成，目前国内对发酵法生物合成安普霉素的研究主要通过菌种选育、培养条件的优化或发酵工艺的优化以提高发酵水平。1997年熊宗贵在《尼拉霉素单组份—安普霉素高产菌株的研究》中对单组份安普霉素高产突变株9008、003、021进行考察和均匀设计方法优化，使摇瓶发酵效价达到6800ug/ml。2005年孙桂梅在《安普霉素的菌种选育》中通过连续耐受试验及NTG诱变处理并复合筛选模型进行菌种选育，从原始效价3000ug/ml提升到3800～4900ug/ml。2002年田威在《安普霉素产生菌的研究》中经过对培养基、通气量、种龄等工艺条件优化，在4m3发酵罐上平均达到了4478ug/ml，最高达到5390ug/ml。公开号为CN104232709A的中国专利申请公开了一种发酵生产安普霉素的方法，该方法包括斜面培养、种子液培养和发酵培养三个步骤，该方法主要是在发酵摇瓶培养过程中加入玉米浆，提高了发酵单位，培养完成后发酵效价可以达到8400U/mL。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种工业微生物发酵生产安普霉素的方法，该方法能够有效的大幅提高安普霉素的发酵水平，发酵单位最高能够达到12000ug/ml。为达到本专利技术上述目的，通过以下技术方案实现。一种高水平发酵生产安普霉素的方法，包括以下步骤：a、斜面培养：将安普霉素生产菌株速冻孢子液接种于斜面培养基中，每支斜面的速冻孢子液接种量为0.05～0.1ml，接种后斜面于35～39℃，湿度30～60％环境下培养5～7天，成熟后得到斜面孢子，直接进入下一步或者于4℃冰箱保存。b、种子液培养：将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中，500ml三角瓶装量50ml，每个种瓶的斜面孢子的接种量为1～2cm2菌苔。在温度35～39℃、湿度30～60％、转速180～220rpm条件下培养20～24h，成熟后得到种子液。c、种子罐培养：将种子培养基装入15L种子罐中，118～121℃灭菌30min完成后，接入b所得的成熟的种子液，通入无菌空气，转速200～350rpm，培养16～28h。d、发酵罐培养：将发酵培养基装入50L发酵罐中，118～121℃灭菌30min完成后，移入c所得的成熟的种子液，通入无菌空气，转速200～550rpm，培养90～120h，得到安普霉素发酵液。作为优选，步骤a中，斜面培养基组成为(质量百分比)：可溶性淀粉2.0％、牛肉膏0.1％、磷酸氢二钾0.05％、氯化钠0.05％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.001％、硝酸钾0.1％、琼脂1.8～2.0％，其余为水。速冻孢子液接种至斜面培养基培养后，斜面上菌苔厚且丰满，颜色均一，成熟时灰白色。作为优选，步骤b中，种瓶培养基组成为(质量百分比)：葡萄糖1.0％、玉米粉0.5％、豆饼粉1.0％、酵母粉0.1％、蛋白胨0.3％、轻质碳酸钙0.1％，其余为水。斜面菌苔接入种瓶中，培养完成后镜检观察菌丝粗壮，应有较多分枝，无杂菌。作为优选，步骤b中，种瓶的培养条件湿度在40～50％，摇床转速200rpm，培养时间24h。此步骤所选择的条件有利于达到上一段种瓶培养基的描述。作为优选，步骤c中，种子罐培养基组成(质量百分比)为：葡萄糖1.0％、玉米粉0.5％、豆饼粉1.0％、酵母粉0.1％、蛋白胨0.3％、轻质碳酸钙0.1％、磷酸氢二钾0.1％、泡敌0.01％，其余为水。作为优选，步骤c中，15L种子罐的装料量为10L，保持培养温度36～38℃，通气比0.5～1.0，转速200～350rpm，维持发酵液溶氧量30～50％，培养20～24h，成熟的种子镜检菌丝初成网状，大部分菌丝已断裂成菌丝段，染色较深，无杂菌。作为优选，步骤d中，发酵培养基组分(质量百分比)为：葡萄糖6.0％、玉米粉1.5％、黄豆饼粉5.0％、蛋白胨0.5％、氯化铵0.5％、硫酸镁0.4％、氯化锰0.03％、硫酸锌0.003％、硫酸亚铁0.005％、硝酸钾0.02％、轻质碳酸钙0.5％、α-淀粉酶0.001％、磷酸氢二钾0.3％、泡敌0.1％、精制豆油0.5％，其余为水。作为优选，步骤d中，50L发酵罐的装料量为30L，保持培养温度36～38℃，通气比0.5～2.0，转速200～550rpm，维持发酵液溶氧量20～30％。作为优选，步骤d中，发酵培养开始后，测定发酵液中葡萄糖含量，在恰当的时间补入无菌葡萄糖液并通过补加无菌葡萄糖液维持发酵液葡萄糖质量百分比浓度在0.1～1.0％，进一步优选为0.5～0.8％。作为优选，步骤d中，随着发酵时间的延长，发酵pH会不断下降，在恰当的时间补入氨水控制发酵pH维持在一定范围内。作为优选，补入无菌葡萄糖液的时间在发酵培养40～60h左右。作为优选，无菌葡萄糖液的补加量为发酵体积的5～15％。作为优选，补加氨水的时间为发酵培养时间50～70h。作为优选，控制发酵pH的最佳范围为6.30～7.00。同现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：本专利技术所述的发酵生产安普霉素的方法，通过在种子罐和发酵罐中添加磷酸氢二钾，使得种子的活力得到有效提升，并大大缩短了种子移入发酵后的适应期，菌丝快速生长，能够使菌丝提前进入抗生素合成期。在发酵过程中针对溶氧变化反应菌丝活力来调节发酵液中的葡萄糖浓度在一定范围内，并通过补氨控制发酵液pH，能够最大程度的发挥菌丝应有的合成能力，延长生产菌的产抗周期，使发酵单位显著提高，培养完成后最高发酵效价达到12000ug/ml左右。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步解释说明，其描述较为具体和详细，但不能因此而理解为对本专利技术范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应包括在本专利技术权利要求的保护范围之内。实施例1各培养基组分如下：斜面培养基组成为(质量百分比)：可溶性淀粉2.5％、牛肉膏0.1％、磷酸氢二钾0.05％、氯化钠0.05％、硫酸镁0.07％、硫酸亚铁0.002％、硝酸钾0.1％、琼脂2.0％。其余为水。种瓶培养基组成为(质量百分比)：葡萄糖4.0％、玉米粉2％、豆饼粉1.0％、酵母粉0.1％、蛋白胨0.5％、轻质碳酸钙0.1％、硫酸镁0.1％。其余为水。种子罐培养基组成为(质量百分比)：葡萄糖4.0％、玉米粉1.5％、豆饼粉2.0％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.8％、轻质碳酸钙0.2％、磷酸氢二钾0.02％、泡敌0.01％。其余为水。发酵培养基组分为(质量百分比)：葡萄糖6.0％、玉米本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高水平发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、斜面培养：将安普霉素生产菌株速冻孢子液接种于斜面培养基中，每支斜面的速冻孢子液接种量为0.05～0.1ml，接种后斜面于35～39℃，湿度30～60％环境下培养5～7天，成熟后得到斜面孢子；b、种子液培养：将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中，种瓶培养基装量50～100ml，每个种瓶的斜面孢子的接种量为1～2cm2菌苔，在温度35～39℃、湿度30～60％、转速180～220rpm条件下培养20～24h，成熟后得到种子液；c、种子罐培养：将种子培养基装入15～20L种子罐中，118～121℃灭菌完成后，接入步骤b所得的成熟的种子液，通入无菌空气，转速200～350rpm，空气流量0.6～1.2m3/h，培养16～28h；d、发酵罐培养：将发酵培养基装入50～60L发酵罐中，118～121℃灭菌完成后，移入步骤c所得的成熟的种子液，通入无菌空气，转速200～550rpm，空气流量0.8～4.0m3/h培养90～120h，得到安普霉素发酵液。

【技术特征摘要】
1.一种高水平发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、斜面培养：将安普霉素生产菌株速冻孢子液接种于斜面培养基中，每支斜面的速冻孢子液接种量为0.05～0.1ml，接种后斜面于35～39℃，湿度30～60％环境下培养5～7天，成熟后得到斜面孢子；b、种子液培养：将步骤a制备得到的斜面孢子接种于种瓶培养基中，种瓶培养基装量50～100ml，每个种瓶的斜面孢子的接种量为1～2cm2菌苔，在温度35～39℃、湿度30～60％、转速180～220rpm条件下培养20～24h，成熟后得到种子液；c、种子罐培养：将种子培养基装入15～20L种子罐中，118～121℃灭菌完成后，接入步骤b所得的成熟的种子液，通入无菌空气，转速200～350rpm，空气流量0.6～1.2m3/h，培养16～28h；d、发酵罐培养：将发酵培养基装入50～60L发酵罐中，118～121℃灭菌完成后，移入步骤c所得的成熟的种子液，通入无菌空气，转速200～550rpm，空气流量0.8～4.0m3/h培养90～120h，得到安普霉素发酵液。2.根据权利要求1所述的高水平发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，步骤a中，以质量百分比计，斜面培养基含有以下组分：可溶性淀粉2.0～3.0％、牛肉膏0.1～0.3％、磷酸氢二钾0.02～0.08％、氯化钠0.02～0.06％、硫酸镁0.02～0.07％、硫酸亚铁0.001～0.003％、硝酸钾0.05～0.2％、琼脂1.8～2.0％。3.根据权利要求1中所述的高水平发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，步骤a中，湿度为40～60％，培养时间为5～7天。4.根据权利要求1中所述的高水平发酵生产安普霉素的方法，其特征在于，步骤b中，以质量百分比计，种瓶培养基含有以下组分...

【专利技术属性】
技术研发人员：金鑫强，吴伟，朱炀，黄大康，纪春华，楼永亮，金明平，
申请(专利权)人：浙江普洛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33