一种研究Cas9蛋白识别靶基因位点时构象变化的方法技术

本发明专利技术公开了一种研究Cas9蛋白识别靶基因位点时构象变化的方法，通过改造sgRNA的SL2区域使Cas9蛋白能够固定于玻片上并且保持功能，并对Cas9蛋白的突变型C80S/S355C/C574S/S867C进行FRET荧光对标记，从而能够基于单分子荧光共振能量转移真实地反映Cas9构象状态，为体外研究CRISPR/Cas9体系的结构

【技术实现步骤摘要】
一种研究Cas9蛋白识别靶基因位点时构象变化的方法


[0001]本专利技术提供一种体外研究Cas9蛋白识别靶基因位点的方法，具体涉及单分子荧光共振能量转移技术体系在研究Cas9蛋白识别靶基因位点时的构象变化的应用。

技术介绍

[0002]成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)及其相关蛋白9(Cas9)，即CRISPR/Cas9，是存在于细菌中的一种抵御入侵噬菌体和质粒的适应性免疫系统。如今，CRISPR/Cas9系统已被成功改造并被应用于对多种动植物细胞进行基因编辑。CRISPR/Cas9系统主要由Cas9蛋白与单个向导RNA(single guide RNA，sgRNA)两部分组成，Cas9蛋白能在sgRNA的介导下在特定基因位点引入双链DNA断裂，进而实现对基因组的定点编辑。
[0003]尽管大量生物学研究已经对CRISPR/Cas9体系进行了深入详细的剖析，CRISPR/Cas9体系仍然存在诸多普通生物学手段无法解决的问题，但它们对该体系发挥功能至关重要，比如脱靶(off
‑
targeting)效应——Cas9会识别与sgRNA不完全互补的DNA靶标，从而造成错误结合与切割。脱靶问题已经成为CRISPR/Cas9系统应用中的主要挑战之一。对脱靶问题的回答依赖于对Cas9结合和切割DNA机制的解读，而这又与Cas9蛋白的构象密切相关。因此，研究Cas9蛋白的构象有助于精准了解CRISPR/Cas9体系的结构
‑
功能关系，对设计具有优化性质的Cas9并使其发挥新的功能具有重要意义。
[0004]单分子荧光共振能量转移(single
‑
molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer,smFRET)技术是基于两个荧光分子在空间距离很近时产生的一种能量转移现象而发展的成像方法，是目前在水溶液中研究生物分子动态行为的重要单分子技术之一，可以在纳米尺度提供单个生物分子(蛋白质、核酸等)内部或分子间的空间信息。smFRET已被多个团队用来监测Cas9蛋白的构象变化。
[0005]然而，目前对Cas9在结合DNA时构象变化的smFRET研究结果不尽相同。例如，有研究发现Cas9在结合DNA时只是短暂地采取具有活性的闭合状态(高FRET状态)，并且这已经足够其完成后续的DNA切割；然而，另一项研究则发现Cas9或者失去核酸酶活性的Cas9(nuclease
‑
deactivated Cas9,dCas9)在与sgRNA的spacer序列完全互补的DNA底物存在时，将长时间维持在闭合状态(高FRET状态)。两团队均通过对sgRNA的3
’
端进行改造来将Cas9/sgRNA复合物固定在玻片上——前者通过在sgRNA的3
’
端连接一个生物素(biotin)分子，利用生物素与玻片上链霉亲和素(Streptavidin)的相互作用从而把复合物固定在玻片上；后者通过将sgRNA的3
’
端延长并与一个5
’
端连接有biotin的寡核苷酸tether互补，通过biotin
‑
tether与玻片上Streptavidin的相互作用从而间接实现Cas9/sgRNA复合体在玻片上的固定。前人的研究表明，dCas9与Cas9在sgRNA的介导下结合特定基因位点的能力没有区别，两者皆可被用于研究Cas9识别靶基因位点的机制。在活细胞中的研究显示，对sgRNA不同位置进行改造对dCas9/sgRNA复合体在活细胞中结合特定基因位点的能力具有不同的影响，对sgRNA的3
’
端进行改造会显著降低dCas9/sgRNA的标记效率，这些研究结果提示改
造sgRNA的3
’
端会影响Cas9/sgRNA结合DNA的能力。因此，前述smFRET研究结果的不同可能是因为他们对sgRNA的3
’
序列进行了不同的改造，这些改造影响了结合有sgRNA的Cas9的构象表现，从而产生了不同的FRET信号变化。

技术实现思路

[0006]现有文献表明，在活细胞中dCas9在与经由茎环结构2(Stem Loop 2，SL2)改造后的sgRNA结合后能够准确地标记特定基因位点，而与经3
’
端改造后的sgRNA结合后对特定基因位点的标记能力显著降低。因此，现阶段在smFRET实验中所采取的sgRNA改造方法(改变sgRNA的3
’
区域)无法阐明Cas9的真实构象状态。本专利技术通过改造sgRNA的SL2区域(茎环结构2，Stem Loop 2)，使Cas9蛋白能够固定于玻片上并且保持功能，发展了一种能够最真实反映Cas9构象状态的体外smFRET研究体系。
[0007]本专利技术提供的技术方案如下：
[0008]对sgRNA构型进行改造：在sgRNA的SL2区域中插入一段特殊序列(TS)，使其可与生物素(biotin)修饰的寡核苷酸(biotin
‑
oligo)杂交互补，并通过体外转录获得改造后的sgRNA，命名为SL2
‑
sgRNA
‑
TS。本专利技术实施例中使用的编码TS的序列为5
’‑
CAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAG
‑3’
(SEQ ID No：1)，除此之外，可使用其它与sgRNA无关的序列作为TS序列插入。
[0009]制备dCas9蛋白(与野生型Cas9在sgRNA的介导下结合特定基因位点的能力没有区别)：利用马来酰亚胺(Maleimide)与半胱氨酸(Cystine，Cys)所带巯基(
‑
SH)之间的化学反应，将荧光团连接到蛋白的目标标记位点上，实现对dCas9蛋白的FRET荧光对标记。首先，我们对dCas9蛋白进行定点突变，将野生型dCas9原有的Cys突变为Ser，同时将目标标记位点——dCas9的第355个和第867个氨基酸突变为Cys，得到dCas9突变型(C80S/S355C/C574S/S867C)，该dCas9突变型已被多个研究团队证实不会影响其自身的相关功能。将该片段克隆至大肠杆菌蛋白表达载体中，利用大肠杆菌蛋白表达系统诱导表达并纯化出上述突变型dCas9蛋白(命名为dCas9
HNH
)。然后，将荧光团Cy3
‑
maleimide、Cy5
‑
maleimide与dCas9
HNH
按5:5:1的比例混合并反应，使用脱盐柱Sephadex G
‑
25(PD
‑
10，GE)去除未反应的游离荧光团，获得dCas9
HNH
‑
Cy3/Cy5。除此之外，该蛋白也可使用其他FRET荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种研究Cas9蛋白识别靶基因位点时构象变化的方法，包括：1)在sgRNA的SL2区域中插入一段特殊序列TS，使其可与生物素修饰的寡核苷酸biotin
‑
oligo杂交互补，并通过体外转录获得该改造后的sgRNA，命名为SL2
‑
sgRNA
‑
TS；2)制备生物素修饰的寡核苷酸biotin
‑
oligo，该寡核苷酸含有与TS杂交互补的序列；3)制备Cas9蛋白或dCas9蛋白的突变型C80S/S355C/C574S/S867C，并对该突变型蛋白进行FRET荧光对标记；4)制备靶标双链DNA，该靶标双链DNA含有与SL2
‑
sgRNA
‑
TS的spacer序列互补的靶标序列及与其相邻的PAM序列；5)在盖玻片表面修饰上带有生物素的聚乙二醇Biotin
‑
PEG，获得功能化盖玻片，然后在该功能化盖玻片表面孵育中性亲和素，使之与盖玻片表面的Biotin
‑
PEG结合；再在修饰有中性亲和素的功能化盖玻片上孵育步骤2)制备的biotin
‑
oligo，通过生物素与中性亲和素的反应将biotin
‑
oligo连接在盖玻片上；6)将步骤3)制备的Cas9蛋白或dCas9蛋白的突变型与步骤1)获得的SL2
‑
sgRNA
‑
TS在体外混合孵育，形成Cas9/sgRNA复合物或dCas9/sgRNA复合物；同时，将Cas9蛋白或dCas9蛋白的突变型与SL2
‑
sgRNA
‑
TS、靶标双链DNA在体外混合孵育，形成Cas9/sgRNA/DNA复合物或dCas9/sgRNA/DNA复合物；7)分别将步骤6)获得的复合物在步骤5)获得的盖玻片上孵育，通过biotin
‑
oligo与SL2
‑
sgRNA
‑
TS中TS的杂交互补，将复合物特异性连接在盖玻片表面；8)通过全内反射荧光显微镜采集步骤7)处理后的盖玻片表面的单分子FRET荧光信号，通过对单分子FRET效率的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈匡时，吴若楠，秦金珊，吴小天，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：