一种核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方法技术

一种核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方法，利用发夹状探针H1、荧光分子FAM修饰的第一信号探针H2和TAMRA修饰的第二信号探针H3，肿瘤外泌体与发夹状探针H1的核酸适配体部分结合，打开发夹状探针H1，释放杂交链式反应所需的触发序列I，引发第一信号探针H2和第二信号探针H3发生杂交链式反应形成长的双链，第一信号探针H2的荧光分子FAM和第二信号探针H3上的荧光分子TAMRA在形成的双链上彼此靠近，并发生荧光共振能量转移，通过荧光分子FAM和TAMRA荧光信号比值即可对肿瘤外泌体进行定量检测。检测特异性好，提高在复杂样品中的适用性。且灵敏度较高，避免目前大多数外泌体检测所需要的繁琐分离过程及其可能引起的误差，有显著的社会和经济效益。社会和经济效益。社会和经济效益。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方法


[0001]本专利技术属于外泌体检测
，特别是一种核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方法。

技术介绍

[0002]肺癌是一种常见的恶行肿瘤，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤前列。检测肿瘤组织分泌进入血液等体液中生物标志物的液体活检技术，是近年来发展起来的一种肿瘤诊断新方法。该方法具有采样创伤小、检测方便等优势，是肿瘤早期诊断比较理想的方法。在肿瘤液体活检中，检测标志物的选择至关重要。外泌体是一种细胞主动分泌的直径为30
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150 nm的脂质双分子层结构囊泡，是介导蛋白质、核酸和代谢物在细胞间进行传递的重要通信介质，研究表明，它与肺癌的发生及转移等过程密切相关。肿瘤外泌体携带有大量肿瘤细胞的信息，如其表面含有多种肿瘤细胞特有的跨膜蛋白及受体，内部装载有大量肿瘤miRNA、DNA、蛋白等分子，因此，血液中的肿瘤外泌体是一种非常有应用潜力的一种肿瘤标志物。
[0003]目前的外泌体检测方法主要有纳米颗粒追踪分析法（Nanoparticle tracking Analysis，NTA）、酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方法，其特征在于，利用识别肿瘤外泌体的发夹状探针H1、荧光分子FAM修饰的第一信号探针H2和TAMRA修饰的第二信号探针H3，当存在肿瘤外泌体时，肿瘤外泌体与发夹状探针H1的核酸适配体部分结合，打开发夹状探针H1，释放杂交链式反应所需的触发序列I，引发第一信号探针H2和第二信号探针H3发生杂交链式反应形成长的双链，第一信号探针H2的荧光分子FAM和第二信号探针H3上的荧光分子TAMRA在形成的双链上彼此靠近，并发生荧光共振能量转移，伴随着荧光分子TAMRA荧光信号的增加，而荧光分子FAM荧光信号降低，两者的荧光差异与体系中的肿瘤外泌体的浓度正相关，通过荧光分子FAM和TAMRA荧光信号比值即可对肿瘤外泌体进行定量检测。2.根据权利要求1所述的核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方法，其特征在于，所述发夹状探针H1是由核酸适配体序列apt和杂交链式反应的触发序列I通过延长序列形成发夹结构，触发序列I由于分子内的核酸杂交处于锁定状态；发夹状探针H1中的核酸适配体序列apt与肿瘤外泌体结合后，释放杂交链式反应所需的触发序列I。3.根据权利要求1所述的核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方法，其特征在于，所述第一信号探针H2和第二信号探针H3序列存在部分互补，在第一信号探针H2的3
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端和第二信号探针H3的环部分别修饰能发生荧光共振能量转移的荧光分子FAM和TAMRA。4.根据权利要求1所述的核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）、识别探针的制备：将含有核酸适配体序列apt与触发序列I的探针溶解于含有250 nM葡萄糖、5 mM MgCl2·
6H2O的PBS缓冲溶液中，探针浓度为400 nM，将该溶液至于涡旋混合仪上30 s混匀，然后置于水浴中，逐渐升温至90℃，10 min后取出，缓慢冷却至室温，利用核酸的互补杂交反应，得发夹状探针H1，即识别探针；（2）、信号探针的制备：用含有250 nM葡萄糖、5 mM MgCl2·
6H2O的PBS缓冲溶液分别溶解荧光分子FAM修饰的第一信号探针H2和荧光分子TAMRA修饰的第二信号探针H3，第一信号探针H2和第二信号探针H3的浓度均为800 nM，涡旋混合仪上30 s混匀，然后置于水浴中，逐渐升高温度至90℃，10 min后取出，缓慢冷却至室温，然后分别与相同量的第一信号探针H2和第二信号探针H3混合，涡旋混合仪上30 s混匀，即得信号探针；（3）、肿瘤外泌体检测：在细胞溶液中加入上述步骤制备的识别探针和信号探针，其中，识别探针的浓度和信号探针的浓度比为1:4，反应3h，当没有肿瘤外泌体存在时，识别探针中的触发序列I不能触发信号探针的杂交链式反应，此时荧光分子FAM和TAMRA距离较远，检测不到FAM和TAMRA之间的FRET信号，当存在肿瘤外泌体时，利用荧光分光光度计检测反应液在480 nm激发光激发下，荧光分子FAM和TAMRA的荧光发射强度，实现对肿瘤外泌体进行定量检测。5.根据权利要求1
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4任一项所述的核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方法，其特征在于，所述的肿瘤外泌体为肺癌A549细胞。6.根据权利要求5所述的核酸适配体识别的肿瘤外泌体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）、肺癌A549细胞培养及外泌体提取：用含有质量浓度10%的无外泌体胎牛血清FBS的RPMI 1640培养基作为细胞培养液，培养液中补加质量浓度1%的青霉素或链霉素，将肺癌A549细胞在含有体积浓度5%的二氧化碳恒温箱中培养，温度为37℃，当细胞生长至80
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90%
时，收集细胞上清液；将收集的细胞上清液用离心超滤法分离纯化其中的细胞外泌体，具体为：在2500 g的离心条件下，对收集的细胞上清液进行离心30 min，然后将上清用0.22 m的超滤膜进行过滤，除去其中的细胞碎片，接着在5000 g的条件下，用100 kDa的超滤管对收集液进行离心处理30min，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘卫，史进进，张开翔，刘军杰，张振中，褚梦雨，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：