一种用于预测心肌细胞移植免疫排斥反应的体外实验模型制造技术

本发明专利技术属于细胞技术领域，涉及一种用于预测心肌细胞移植免疫排斥反应的体外实验模型，获取目标对象的PBMC细胞，与待移植的iCM细胞；将PBMC与iCM在体外进行间接共培养，iCM接种在Transwell小室的上室，PBMC接种在Transwell小室的下室，培养过程中，上室的培养液与下室的培养液能相互渗透；检测PBMC中T细胞、B细胞和NK细胞的激活与增殖情况；所述PBMC的接种密度2.5*105/ml，所述iCM细胞是经由iPSC或ESC分化而来。该间接共培养方法可有效提高iCM临床应用前预测免疫排斥反应检测结果的准确性，同时，该方法具有重现性高、实验数据波动小等特点。点。点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于预测心肌细胞移植免疫排斥反应的体外实验模型


[0001]本专利技术属于细胞
，涉及一种用于预测心肌细胞移植免疫排斥反应的体外实验模型。

技术介绍

[0002]心脏病治疗中一个提前挑战是心脏病发作后导致部分心肌死亡，心脏无法再生肌肉组织，死亡的肌肉组织还会导致周围的肌肉损伤，进而导致致命的心脏扩张。采用注入心肌细胞代替受损的心肌，是心脏病研究专家所探索的一种治疗心脏疾病的新方向。
[0003]在将心肌细胞应用于临床之前，对其可能产生的免疫排斥是必须进行的关键环节；如果直接将生产的心肌细胞用于动物实验或人体实验，其可能免疫排斥反应将不可预期。
[0004]因此，在体外进行免疫排斥反应的反应设计，其一是能够降低体内实验的风险性，方便更好的观察心肌细胞本身对心脏系统疾病的治疗效果；其二，能够有效建立临床应用过程中心肌细胞注射的检测指标，以为未来人iPSC来源心肌细胞（iCM）的临床应用提供更加全面的临床前研究证据。

技术实现思路

[0005]本申请提供一种用于预测心肌细胞移植免疫排斥反应的体外实验模型，体外验证模型主要基于PBMC与iCM的间接共培养体系设计实现。该间接共培养方法可有效提高iCM临床应用前预测免疫排斥反应检测结果的准确性，同时，该方法具有重现性高、实验数据波动小等特点。
[0006]为实现上述技术目的，本申请采取的技术方案为，一种用于预测心肌细胞移植免疫排斥反应的体外实验模型，获取目标对象的PBMC细胞，与待移植的iCM细胞；将PBMC与iCM在体外进行间接共培养，iCM接种在Transwell 小室的上室，PBMC接种在Transwell 小室的下室，培养过程中，上室的培养液与下室的培养液能相互渗透；检测PBMC中T细胞、B细胞和NK细胞的激活与增殖情况；所述PBMC的接种密度2.5*105/ml，所述iCM细胞是经由iPSC或ESC分化而来。
[0007]作为本申请改进的技术方案，将PBMC与iCM基于Transwell体系进行间接共培养，培养时间介于48
‑
96h。
[0008]作为本申请改进的技术方案，将PBMC与iCM在体外进行间接共培养时，按梯度设计PBMC与iCM的数量比，并且实验过程中至少选择2个数量比进行检测。
[0009]作为本申请改进的技术方案，体外实验模型的建立方式包括初步建立模型与模型验证，以及结果的判定；其中，初步建立模型，将商品化的PBMC与抗体共培养，筛选最大程度激活PBMC时PBMC的用量，并确认为体外实验模型时PBMC的用量；模型验证，在初步建立模型的基础上将患者的PBMC与iCM进行间接共培养，比较间
接共培养后PBMC中T细胞、B细胞和NK细胞相对于PBMC单独培养状态下T细胞、B细胞和NK细胞的激活状态与增殖情况；结果的判定，评估阳性对照激活情况、阴性对照激活情况、测试样品激活情况；所述阳性对照组设计为将PBMC单独培养，并在培养基中加入抗体以激活PBMC，检测阳性对照激活情况；所述阴性对照组设计为将PBMC单独培养，检测阴性对照激活情况。
[0010]作为本申请改进的技术方案，对结果的判定还包括规定阳性对照中至少有T细胞激活、阴性对照无激活、测试样品中至少一种细胞类型激活的情况判定为预测出现异常免疫反应。
[0011]作为本申请改进的技术方案，所述抗体为T Cell TransAct
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human，加入量是0.5ul。
[0012]作为本申请改进的技术方案，将PBMC与iCM基于Transwell体系进行间接共培养时，PBMC培养基采用的是添加有FBS的1640培养基，FBS体积分数为10%；iCM培养基采用的是添加有FBS和B27的1640培养基，FBS体积分数5%，B27体积分数2%。
[0013]作为本申请改进的技术方案，设计PBMC与iCM的数量比为1:（0.25
‑
1）。
[0014]作为本申请改进的技术方案，进行间接共培养时要求所述iCM的活率不小于70%，纯度不小于95%。
[0015]有益效果本申请选择采用PBMC与iCM进行体外间接共培养进行心肌细胞移植免疫排斥反应的体外验证。体系设计的技术依据：外周血单个核细胞（PBMC）参与人体的免疫调节作用。外周血单个核细胞主要包括两大类细胞，分别是淋巴细胞和单核细胞，其中淋巴细胞又包括T淋巴细胞，B淋巴细胞和NK细胞。其中T淋巴细胞是机体免疫系统的重要组成占比约为45
‑
70%，T淋巴细胞在经抗原刺激等条件激活后，可分化为多种细胞亚群，从而引起一定的免疫反应。PBMC与iCM间接共培养能够模拟心肌细胞移植后的体内微环境，故研究心肌细胞与PBMC之间的间接共培养体外实验，能为未来人iPSC来源心肌细胞（iCM）的临床应用提供更加全面的临床前研究证据。
[0016]本申请采用梯度设计间接共培养PBMC和iCM的数量比，能够最大概率的概括PBMC能被激活的可能性，为预测心肌细胞移植产生的免疫排斥给出最大可能性的预测，有效提高验证效率。
[0017]本申请由于PBMC是悬浮生长、iCM是贴壁生长，在间接共培养时既要避免PBMC与iCM细胞直接接触以防止二者之间表面蛋白相互作用，又要保证二者之间的培养液能够充分交互。本申请采用Transwell培养体系，并将iCM接种于上室，将PBMC接种于下室，实现二者的间接共培养。
[0018]为了避免PBMC与iCM间接共培养过程中二者的培养基交互影响细胞的生长，本申请还约束PBMC的培养基与iCM培养基，避免带来实验过程中的干扰项。
附图说明
[0019]图1 绘示抗体用量0.5ul时的流式细胞术测试结果图；图2 绘示抗体用量0.1ul时的流式细胞术测试结果图；图3 绘示PBMC用量为10W时流式细胞术测试结果图；
图4 绘示PBMC用量为15W时流式细胞术测试结果图；图5 绘示PBMC用量为20W时流式细胞术测试结果图；图6 绘示PBMC用量为25W时流式细胞术测试结果图；图7 绘示PBMC用量为50W时流式细胞术测试结果图；图8 绘示患者一的实验组一流式细胞术测试结果图；图9 绘示患者一的实验组二流式细胞术测试结果图；图10 绘示患者一的实验组三流式细胞术测试结果图；图11 绘示患者一的阴性组流式细胞术测试结果图；图12 绘示患者一的阳性组流式细胞术测试结果图；图13 绘示患者二的实验组一流式细胞术测试结果图；图14 绘示患者二的实验组二流式细胞术测试结果图；图15 绘示患者二的阴性组流式细胞术测试结果图；图16 绘示患者二的阳性组流式细胞术测试结果图。
具体实施方式
[0020]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本专利技术的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于预测心肌细胞移植免疫排斥反应的体外实验模型，其特征在于：获取移植目标对象的PBMC细胞，与待移植的iCM细胞；将PBMC与iCM基于Transwell体系在体外进行间接共培养，iCM接种在Transwell 小室的上室，PBMC接种在Transwell 小室的下室；培养过程中，上室的培养液与下室的培养液能相互渗透；检测间接共培养后PBMC中T细胞、B细胞和NK细胞的激活与增殖情况；所述PBMC的接种密度2.5*105/ml，所述iCM细胞是经由iPSC或ESC分化而来。2.根据权利要求1所述的一种用于预测心肌细胞移植免疫排斥反应的体外实验模型，其特征在于：培养时间介于48
‑
96h。3.根据权利要求1所述的一种用于预测心肌细胞移植免疫排斥反应的体外实验模型，其特征在于，将PBMC与iCM在体外进行间接共培养时，按梯度设计PBMC与iCM的数量比，并且实验过程中至少选择2个数量比进行检测。4.根据权利要求1所述的一种用于预测心肌细胞移植免疫排斥反应的体外实验模型，其特征在于，体外实验模型的建立方式包括初步建立模型与模型验证，以及结果的判定；其中，初步建立模型，将商品化的PBMC与抗体共培养，筛选最大程度激活PBMC时PBMC的用量，并确认为体外实验模型时PBMC的用量；模型验证，在初步建立模型的基础上将患者的PBMC与iCM进行间接共培养，比较间接共培养后PBMC中T细胞、B细胞和NK细胞相对于PBMC单独培养状态下T细胞、B细胞和NK细胞的激活状态与增殖情况；结果...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐菲，张月辉，陈涛涛，王嘉显，
申请(专利权)人：南京艾尔普再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：