本发明专利技术公开了一种猪FAPs永生化细胞的构建方法及用途。构建方法，包括以下步骤：1）猪FAPs细胞的分离培养；2）转染过表达SV40T的慢病毒；3）抗生素筛选成功转入SV40T慢病毒的猪FAPs细胞。进一步，4）验证猪FAPs永生化细胞的永生化能力；5）建立猪FAPs细胞成纤维分化诱导方法；6）猪FAPs细胞3D培养模型建立。本发明专利技术：1）解决了当下猪FAPs细胞来源的局限，减少了动物牺牲数量，为FAPs细胞相关研究提供了可靠模型；2）可用于研究猪肌内脂肪的形成调控及其分子机制；3）还可用于研究FAPs细胞成脂/成纤维分化的命运决定机制；4）还可用于筛选靶向促进FAPs细胞增殖或成脂分化的营养素、生物活性因子等，为细胞培养肉的研发提供可靠的模型。为细胞培养肉的研发提供可靠的模型。为细胞培养肉的研发提供可靠的模型。
【技术实现步骤摘要】
猪FAPs永生化细胞的构建方法及用途
[0001]本专利技术涉及一种猪永生化成纤维/成脂祖细胞 (fibro
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adipogenic progenitors, FAPs) 的建立方法及用途，属于现代农业和食品研究领域的应用技术。
技术介绍
[0002]沉积在骨骼肌中的肌内脂肪（Intramuscular Fat, IMF）又称为风味脂肪，其含量与猪肉的感官、食用品质密切相关，直接影响肉的风味、多汁性、嫩度、色泽等多个指标。猪肉的理想IMF含量在 2.5%～3.0%，IMF含量低会严重影响肉的风味和口感，降低肉品质。前期研究发现，IMF细胞是由多种来源的干细胞或祖细胞分化而来，包括侧群细胞、周细胞、多能间充质干细胞、肌卫星细胞及FAPs等，其中FAPs是小鼠和人肌肉再生过程中脂肪化的主要细胞来源，FAPs 特异性表达 PDGFRα和 Sca
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1。近期研究同样发现，FAPs是猪肌内脂肪形成的重要细胞来源。因此，如何在不影响猪肉产量的前提下适当提高猪肉中IMF含量，是改善猪肉品质的关键策略。另一方面，从人类健康的角度来看，IMF沉积与衰老、骨骼肌功能异常、糖尿病及其他慢性代谢病密切相关，而猪的生理结构和解剖特性与人类极为相似，被研究者认为是一种接近人类的动物模型。因此，了解猪FAPs的分化、成熟机制等过程，同样为治疗人类疾病提供新的方案。
[0003]就目前来看，猪FAPs相关研究处于起步阶段：没有猪FAPs的相关研究报道；没有成熟的分离纯化方法；只是简单用肌肉消化后的混合细胞研究肌内脂肪细胞分化聚酯，没考虑纯化FAPs等。目前获得猪FAPs的方法是通过免疫磁珠或流式分选PDGFRa
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细胞，这类方法不仅获取成本高（每次需要屠宰动物、获取肌肉组织），并且原代FAPs细胞在体外培养几代之后，培养效率显著下降。
技术实现思路
[0004]为了克服现有技术中的问题，本专利技术的目的是提供一种猪 FAPs 永生化细胞的构建方法及用途。
[0005]猪 FAPs永生化细胞的构建方法及用途，包括以下步骤：1）猪 FAPs细胞的分离培养：将3日龄仔猪麻醉后，将其体表用酒精擦拭、消毒，随后在无菌超净台中取背最长肌，充分剪碎组织后按组织体积：消化酶体积=1：3加入0.2% 胶原酶Ⅰ；在 37 ℃消化1 h后，依次经70 μm和40 μm的滤网过滤，离心后收集细胞；随后经磁珠分选方法分离PDGFRα阳性细胞（即FAPs细胞），接种于12孔板培养；2）转染过表达SV40T的慢病毒：待细胞生长至40%左右，加入慢病毒，感染72 h后观察荧光，检测转染效率；3）抗生素筛选成功转入SV40T慢病毒的猪 FAPs细胞：待感染SV40T慢病毒的猪 FAPs细胞生长至90%时，根据慢病毒本身的抗性基因，利用嘌呤霉素筛选转入SV40T慢病毒的猪 FAPs细胞；4）验证猪 FAPs永生化细胞的永生化能力：经嘌呤霉素筛选纯化得到的SV40T阳性
的猪 FAPs细胞记为第1代（P1），待细胞生长至80%～85%时传代，在P5、P10、P15、P20、P25、P30代时进行增殖（KI67染色）和成脂分化能力（尼罗红染色）检测。
[0006]5）建立猪 FAPs细胞成纤维分化诱导方法：含5% FBS的基础培养基中10ng/mL TGFβ1处理48h，可诱导猪 FAPs细胞成纤维分化。经免疫荧光染色和实时荧光定量PCR（RT
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PCR）检测发现，成纤维诱导显著提高纤维化标志基因Acta2和Col3a的表达水平。
[0007]6）猪 FAPs永生化细胞应用于3D培养、细胞培养肉研发：将猪 FAPs细胞接种于3D凝胶体系培养，FAPs细胞具有较好的增殖能力，且能形成细胞球。
[0008]一种根据所述的猪 FAPs永生化细胞，表达PDGFRα；一种根据所述的猪 FAPs永生化细胞的构建方法及用途，用于研究猪肌内脂肪的形成调控及其分子机制，用于研究FAPs细胞成脂/成纤维分化的命运决定机制，用于研究猪 FAPs 细胞成脂/成纤维分化过程中糖脂代谢规律以及基因功能，还可用于培养肉生产、筛选靶向促进FAPs细胞增殖或成脂分化的营养素和生物活性因子等。
[0009]本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种猪 FAPs 永生化细胞的构建方法，克服每次FAPs分离时动物的牺牲量，满足动物福利的要求；同时，确定了猪FAPs细胞的感染复数（Multiplicity of infection, MOI），为后期转染慢病毒、腺病毒以及基因功能研究提供参考；通过体外培养，确定了诱导猪 FAPs成纤维分化的方法，这为调控猪 FAPs的分化命运提供有力的模型；通过将猪 FAPs用于3D培养，证明猪 FAPs在体外有较好的成球能力，这为后期细胞培养肉的研发提供了新方案。
[0010]本专利技术建立的猪 FAPs 永生化细胞在体外长期保持良好的前体状态，传代至第30代仍具有较好的增殖和分化能力，可用于体外探究调控猪 FAPs 细胞成脂、成纤维分化等方面的研究，开拓了目前研究猪肌内脂肪沉积及 FAPs 细胞分化命运调控研究的新方法；其次，分离得到的猪 FAPs 细胞可用于3D 细胞培养，可以探究体内条件下肌内脂肪的形成机制；而且，FAPs 细胞是肌内脂肪的主要细胞来源，可以当作种子细胞在体外用于细胞培养肉的研发、生产；还可用于体外筛选靶向调控FAPs 细胞增殖和分化的营养素和生物活性因子等，为提高培养肉的生产效率、调控猪肌内脂肪沉积提供新方案，应用前景巨大。
附图说明
[0011]图 1 是P1代猪 FAPs 细胞形态观察。
[0012]图 2 是猪 FAPs 细胞的MOI值探究，MOI值约为30。
[0013]图 3 是SV40T慢病毒感染72h 的荧光检测结果。
[0014]图 4 是 puromycin的最适浓度筛选结果，添加4μg/mL的puromycin较好。
[0015]图 5 是用4μg/mL的puromycin 筛选24h 的检测结果。
[0016]图 6 是不同代数猪FAPs细胞的形态观察结果。
[0017]图 7 是不同代数猪FAPs细胞的KI67染色结果。
[0018]图 8 是不同代数猪FAPs细胞的尼罗红染色结果。箭头所指样细胞为FAPs分化成的成熟肌内脂肪细胞。
[0019]图 9 是猪FAPs细胞成纤维分化结果。
[0020]图 10 是3D凝胶系统培养猪FAPs细胞的图片，箭头所指的是死细胞。
[0021]图 11 是猪FAPs细胞球体的图片。
具体实施方式
[0022]下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此。
[0023]（一）、猪 FAPs细胞的分离培养1、猪背最长肌的分离与消化1）将购自杭州灯塔种猪有限公司的3日龄仔猪麻醉后放血处死，用75% 乙醇擦拭仔猪全身，经灭菌处理后，将仔猪转移至无菌超净工作台，取出仔猪本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种猪FAPs永生化细胞的构建方法，其特征是：包括以下步骤：1）猪 FAPs细胞的分离培养：将3日龄仔猪麻醉后，体表用酒精擦拭、消毒，随后在无菌超净台中取背最长肌，充分剪碎组织后按组织体积：消化酶体积=1：3加入0.2% 胶原酶
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；在 37 ℃ 消化1 h后，依次经70 μm和40 μm的滤网过滤，离心后收集细胞；随后经磁珠分选方法分离PDGFRα阳性细胞，即FAPs细胞，接种于12孔板培养；2）转染过表达SV40T的慢病毒：待细胞生长至40%左右，加入慢病毒，感染72 h后观察荧光，检测转染效率；3）抗生素筛选成功转入SV40T慢病毒的猪 FAPs细胞：待感染SV40T慢病毒的猪 FAPs细胞生长至90%时，根据慢病毒本身的抗性基因，利用嘌呤霉素筛选转入SV40T慢病毒的猪 FAPs细胞；得到猪 FAPs永生化细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤4）验证猪 FAPs永生化细胞的永生化能力：经嘌呤霉素筛选纯化得到的SV40T阳性的猪 FAPs细胞记为第1代P1，待细胞生长至80%～85%时传代，在P5、P10、P15、P20、P25、P30代时进行增殖和成脂分化能力检测；猪 FAPs细胞传代至第30代时仍具有增殖和成脂能力。3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤5）诱导FA...
【专利技术属性】
技术研发人员：单体中，刘事奇，有文静，顾馨，涂羽昂，汪以真，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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