一种前列腺癌PCA3分数检测的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种前列腺癌PCA3分数检测的试剂盒及方法，包括引物、探针、荧光定量反应预混液、阳性对照与空白对照，使用商业化RNA保存液保存样品，TRIzol法提取样品的RNA，以提取样品的RNA为模板，将RNA逆转录为cDNA，用PCA3

【技术实现步骤摘要】
一种前列腺癌PCA3分数检测的试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种前列腺癌PCA3分数检测的试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]80％的前列腺癌患者是65岁以上的男性，严重地威胁了男性的健康。前列腺癌全球范围内是男性中发病率第六位的的实体肿瘤，死亡率居第九位，在美国，前列腺癌尤为常见，而在亚洲国家发病率却不高，但近年来随着社会老龄化有逐年升高的趋势，据统计，2018年有近130万的新发病例和35.9万的死亡病例，前列腺特异性抗原(PSA)等生物学标志物作为诊断前列腺癌的应用最广的早期诊断标准，有效的降低了前列癌的死亡率，所以前列腺癌诊疗的发展将越来越重要，随着科技的不断发展，人们对于前列腺癌PCA3分数检测的试剂盒的制造工艺要求也越来越高。
[0003]现有的前列腺癌PCA3分数检测的试剂盒在使用时存在一定的弊端，虽然PSA在前列腺特异表达但并不是在前列腺癌中特异表达，并且还存在4～10ng/ml的灰区，不能区分前列腺癌与前列腺炎、良性前列腺增生，因此在诊断前列腺癌中需要更多的生物学标志物，如前列癌筛查诊断阶段，需要敏感度及特异性更高的生物学标志物来鉴别患者以导向更为明确的诊断及后续措施，对于活检证实的前列腺癌患者，需要生物学标志物来进行分级以指导手术或系统性治疗；对于前列腺癌长期管理患者，需要生物学标志物监测疾病进程并辅助系统性治疗决策，同时各类组学技术的发展，使得更多的候选标志物出现，前列腺癌基因3(PCA3)是一种尿检分子标志物，是前列腺特异性蛋白，在其他组织及肿瘤中均不表达，但在前列腺肿瘤细胞上过度表达，相比于PSA能更好地区分前列腺癌与前列腺炎、良性前列腺增生，与PSA不同，PCA3与前列腺大小及5
‑
α还原酶抑制剂的使用也无关，PCA3大于60，前列腺癌可能性上升，小于20可以作为阴性排查，有助于临床上前列腺癌症病人的早期诊断，用于指导治疗决策并加速前列腺癌精准医学的发展，为此，我们提出一种前列腺癌PCA3分数检测的试剂盒及方法。

技术实现思路

[0004](一)解决的技术问题
[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种前列腺癌PCA3分数检测的试剂盒及方法，进一步提高前列腺癌PCA3基因检测试剂盒的稳定性、灵敏度、准确度等性能，可以有效解决
技术介绍
中的问题。
[0006](二)技术方案
[0007]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种前列腺癌PCA3分数检测的试剂盒，包括引物、探针、荧光定量反应预混液、阳性对照与空白对照，所述引物核苷酸序列如下所示：
[0008]PCA3
‑
F：5'
‑
GGTGGGAAGGACCTGATGATAC
‑
3'；
[0009]PCA3
‑
R：5'
‑
GGGCGAGGCTCATCGAT
‑
3'；
[0010]所述探针的核苷酸序列如下所示：
[0011]PCA3
‑
FAM
‑
P：5'
‑
AGAAATGCCCGGCCGCCATC
‑
3'。
[0012]作为本申请一种优选的技术方案，所述探针5'标记的荧光基团为FAM、VIC、TEXAS RED中的至少一种，探针3'标记的淬灭基团为TAMRA、BHQ中的至少一种。
[0013]一种前列腺癌PCA3分数检测的方法，包括以下操作步骤：
[0014]S1：使用商业化RNA保存液保存样品；
[0015]S2：TRIzol法提取样品的RNA；
[0016]S3：以提取样品的RNA为模板，将RNA逆转录为cDNA；
[0017]S4：用PCA3
‑
F、PCA3
‑
R、探针、PSA内参基因引物PSA
‑
F、PSA
‑
R以及PSA内参基因探针PSA
‑
FAM
‑
P进行定量PCR扩增反应获得扩增产物；
[0018]S5：对扩增产物进行扩增曲线分析，得到基因的Ct值，并代入公式得到PCA3分数＝2^[Ct(PSA)
‑
Ct(PCA3)]×
100；
[0019]S6：若PCA3分数若大于31说明PCA3基因上调表达，若PCA3分数若低于31说明PCA3基因下调表达；若PCA3分数若等于31说明PCA3基因正常表达。
[0020]作为本申请一种优选的技术方案，所述S1步骤中样本采集的具体方案和操作为：
[0021]A1：选取男性前列腺癌患者(实验组)和男性非前列腺癌患者(对照组，镜下白细胞>10)的尿液，每个收集10mL；
[0022]A2：3500rpm离心10min后收集细胞/沉渣，弃去上清；
[0023]A3：将细胞/沉渣等用PBS洗涤一次，离心后弃去上清；
[0024]A4：再用少量的PBS重悬，然后加入2倍体积(～1mL)的RNA followAll保存溶液，装入2mL离心管中；
[0025]A5：在4℃环境下可保存和运输1个月。
[0026]作为本申请一种优选的技术方案，所述S2步骤中RNA提取的具体操作为：
[0027]B1：用冰冷的PBS轻轻漂洗细胞单层(两次)；
[0028]B2：加入1mL TRIZOL裂解细胞为均质样品，室温孵育5min；
[0029]B3：反复吸打，收集到RNase free tube中；
[0030]B4：加入200ul的氯仿，Votex 15s；
[0031]B5：室温孵育3min；
[0032]B6：4℃12000g转15min(可适当延长)；
[0033]B7：吸取上层液500ul加入一个新的tube中；
[0034]B8：加入500ul的异丙醇混匀；
[0035]B9：孵育10min在室温4℃12000g离心10min；
[0036]B10：吸走上清液，加入1ml 75％乙醇洗一下(Votex 10s)；
[0037]B11：4℃7500g离心5min，弃去酒精；
[0038]B12：重复洗一下，尽可能吸干净，后37℃放置30min让酒精和水挥发干净，晾干RNA；
[0039]B13：DEPC水20ul(细胞房分装DEPC水)(测浓度尽可能使浓度集中在500
‑
1000ng/ul)，反复吸打或Votex 10s或37℃孵育10min,溶解沉淀块，
‑
80℃保存。
[0040]作为本申请一种优选的技术方案，所述S3步骤中逆转录的具体操作为：
[0041]C1：配制逆转录体系(在冰上进行)；
[0042]C2：轻柔混匀后进行逆转录反应，条件如下：37℃15min，85℃5sec，4℃。
[0043本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种前列腺癌PCA3分数检测的试剂盒，包括引物、探针、荧光定量反应预混液、阳性对照与空白对照，其特征在于：所述引物核苷酸序列如下所示：PCA3
‑
F：5'
‑
GGTGGGAAGGACCTGATGATAC
‑
3'；PCA3
‑
R：5'
‑
GGGCGAGGCTCATCGAT
‑
3'；所述探针的核苷酸序列如下所示：PCA3
‑
FAM
‑
P：5'
‑
AGAAATGCCCGGCCGCCATC
‑
3'。2.根据权利要求1所述的一种前列腺癌PCA3分数检测的试剂盒，其特征在于：所述探针5'标记的荧光基团为FAM、VIC、TEXAS RED中的至少一种，探针3'标记的淬灭基团为TAMRA、BHQ中的至少一种。3.一种前列腺癌PCA3分数检测的方法，其特征在于：包括以下操作步骤：S1：使用商业化RNA保存液保存样品；S2：TRIzol法提取样品的RNA；S3：以提取样品的RNA为模板，将RNA逆转录为cDNA；S4：用PCA3
‑
F、PCA3
‑
R、探针、PSA内参基因引物PSA
‑
F、PSA
‑
R以及PSA内参基因探针PSA
‑
FAM
‑
P进行定量PCR扩增反应获得扩增产物；S5：对扩增产物进行扩增曲线分析，得到基因的Ct值，并代入公式得到PCA3分数=2^[Ct(PSA)
‑
Ct(PCA3)]
×
100；S6：若PCA3分数若大于31说明PCA3基因上调表达，若PCA3分数若低于31说明 PCA3基因下调表达；若PCA3分数若等于31说明PCA3基因正常表达。4.根据权利要求3所述的一种前列腺癌PCA3分数检测的方法，其特征在于：所述S1步骤中样本采集的具体方案和操作为：A1：选取男性前列腺癌患者（实验组）和男性非前列腺癌患者（对照组，镜下白细胞>10）的尿液，每个收集10mL；A2：3500rpm离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹政，吴炯，施美芳，
申请(专利权)人：邹政，
类型：发明
国别省市：