一种检测植物材料中植物内源小肽激素的纯化富集方法技术

本发明专利技术公开了一种基于反相

【技术实现步骤摘要】
一种检测植物材料中植物内源小肽激素的纯化富集方法


[0001]本专利技术属于分析化学领域，涉及一种检测植物材料中植物内源小肽激素的纯化富集方法。

技术介绍

[0002]小肽是指由天然氨基酸通过肽键首尾相连而成的链状聚合物，其结构介于氨基酸与蛋白质之间，通常由不多于50个氨基酸组成，分子量小于10KDa。活性小肽广泛存在于植物王国中，在维持和调节其正常生理活动中扮演着重要角色。除了番茄系统素(TomSys)，人们在植物中还发现了AtPep、导管分化抑制因子(TDIF)等数十种内源活性调节肽，它们参与调控了植物生长发育的各个生理过程，特别是在细胞
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细胞间的短距离信息交流中起到了关键作用。由于这些植物内源活性小肽具有类似植物激素的作用模式，在极低的生理浓度下即可发挥其生理功能，他们又被称为植物小肽激素。随着“拟南芥基因组计划”的完成及后续其他植物基因组的测序研究，植物小肽激素的发现、鉴定及生理调控机制研究步入了快车道，吸引着越来越多植物生理学家的目光，成为了植物生理学领域的热点研究课题。
[0003]值得注意的是，无论是未知植物活性小肽的发现与鉴定，还是已有植物小肽激素的调控机制探索，亦或是小肽类生物标志物的筛选都离不开内源植物小肽的高效纯化和全面分析。传统植物激素家族分子量小，每类植物小肽激素多含有相似的分子骨架或母核结构，物化性质较为接近，这就给分析方法的开发带来了很大的便利。而植物小肽激素由氨基酸组成，氨基酸个数、种类、序列及各种翻译后修饰的存在致使植物活性肽的结构和理化性质具有极大的多样性，其检测和分析面临着更严峻的挑战。
[0004]目前，由于其良好的分离能力、较高的灵敏度及优秀的序列鉴定与分析能力，LC
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MS技术被广泛应用于植物小肽的检测。高分辨质谱和多级质谱技术的结合极大提高了小肽结构的解析能力和准确性。可是，植物基质往往成分复杂，而植物活性肽含量很低，直接对植物样本提取液进行检测难以获得理想的结果，而且基质中的无机盐等组分容易对质谱造成不可逆损伤。故而，在检测之前需要对植物基质中的内源小肽进行富集和纯化。目前，植物小肽的纯化方法多综合絮凝沉降除蛋白和后期除盐、高效液相色谱、葡萄糖凝胶色谱、快速柱层析、免疫纯化等步骤，在部分植物小肽的分析中表现出色，但仍有较大的改进空间。其一，面对不同的基质或不同的目标小肽，纯化流程不一，所需分离材料各异，有的分离材料无法通过商业化途径获取。其二，像免疫纯化等部分操作对分析人员的技术要求较高，带来了一定的学习时间成本。因此，建立一套简便易行的植物小肽纯化方法是解决这些问题的最佳选择。
[0005]从结构上可知，小肽的基本组成单元为氨基酸，不同氨基酸的组合和排列赋予了小肽结构的多样性。不同氨基酸的亲水性、疏水性、酸性、碱性各异，致使小肽的性质也表现出显著的差异性。基于这些结构特点，植物小肽可以通过反相作用或离子交换作用保留在分离材料上，疏水性越强的反相保留越强，亲水性越强的离子交换作用越强。若同时赋予分离材料反相和离子交换作用位点，则能更大程度的富集多类小肽，而且还可以选择合适的
淋洗溶剂去除杂质的同时避免目标小肽的流失。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种基于反相
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离子交换混合模式固相萃取的植物内源小肽的纯化方法。
[0007]本专利技术提供的纯化植物内源小肽的方法，包括如下步骤：
[0008]1)向植物原料中加入提取溶剂，混匀后静置提取，去除残渣后，收集提取液进行如下处理a；
[0009]所述处理a为上样于1种装填有混合型离子交换与反相保留吸附剂的Oasis固相萃取小柱，得到结合物I；
[0010]2)将步骤1)所得结合物I依次进行淋洗和洗脱，收集洗脱液，浓缩，得到所述植物内源小肽。
[0011]本专利技术提供的筛选植物内源小肽的方法，包括：
[0012]3)向植物原料中加入提取溶剂，混匀后静置提取，去除残渣后，收集提取液进行如下处理b；
[0013]所述处理b为依次上样于2种保留机制互补的装填有混合型离子交换与反相保留吸附剂的Oasis固相萃取小柱，得到结合物II和III；
[0014]4)将步骤3)所得结合物II和III分别进行淋洗和洗脱，收集洗脱液并合并于同一容器中，浓缩，得到所述植物内源小肽。
[0015]上述方法的所述步骤1)和步骤3)中，所述植物内源小肽是指内源存在于植物体内、未经过蛋白酶解的小肽，具体可为已知的植物小肽激素，也可以是未知的植物小肽，更具体为TomSys、TDIF等；
[0016]所述植物原料具体可为水稻、拟南芥或番茄等；
[0017]所述提取溶剂为质量百分浓度为50％
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100％的甲醇水溶液或质量百分浓度为0.1％
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2％的三氟乙酸水溶液；
[0018]所述植物原料的用量不超过1000mg或不超过200mg或不超过100mg；具体为50mg
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1000mg，具体可为50mg
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500mg，更具体可为50mg
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200mg，再具体可为100mg；
[0019]所述植物原料与提取溶剂的用量比为100mg：0.5
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5mL；
[0020]所述提取步骤中，提取方法为各种常规方法，如超声、涡旋、离心或静置等；
[0021]所述提取包括涡旋混匀，超声，4℃下过夜放置并离心；具体的，所述超声中，时间为1
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60min；具体为2
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10min；超声功率为200
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300W；所述离心步骤中，离心转速为9000
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20000rpm；离心力为10000
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20000g；离心时间为10
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20min；
[0022]所述装填有混合型离子交换与反相保留吸附剂的Oasis固相萃取小柱包括混合模式强阳离子交换柱(Mixed
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Mode Strong Cation
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Exchange,MCX)、混合模式弱阳离子交换柱(Mixed
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Mode Weak Cation
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Exchange,WCX)、混合模式强阴离子交换柱(Mixed
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Mode Strong Anion
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Exchange,MAX)和混合模式弱阴离子交换柱(Mixed
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Mode Weak Anion
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Exchange,WAX)，上述固相萃取柱均可从Waters公司购买。
[0023]处理a的目的是借助于反相作用或离子交换作用将提取液中的小肽萃取结合到固相萃取吸附剂上。
[0024]由步骤1)和3)可知，该方法的样品前处理过程只需1
‑
2个Oasis固相萃取柱进行纯化，且使用的固相萃取小柱均可方便的从商品化途径购买。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纯化植物内源小肽的方法，包括：1)向植物原料中加入提取溶剂，混匀后静置提取，去除残渣后，收集提取液进行如下处理a；所述处理a为上样于1种装填有混合型离子交换与反相保留吸附剂的Oasis固相萃取小柱，得到结合物I；2)将步骤1)所得结合物I依次进行淋洗和洗脱，收集洗脱液，浓缩，得到所述植物内源小肽。2.一种筛选植物内源小肽的方法，包括：3)向植物原料中加入提取溶剂，混匀后静置提取，去除残渣后，收集提取液进行如下处理b；所述处理b为依次上样于2种保留机制互补的装填有混合型离子交换与反相保留吸附剂的Oasis固相萃取小柱，得到结合物II和III；4)将步骤3)所得结合物II和III分别进行淋洗和洗脱，收集洗脱液并合并于同一容器中，浓缩，得到所述植物内源小肽。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)和步骤3)中，所述提取溶剂为质量百分浓度为50％
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100％的甲醇水溶液或质量百分浓度为0.1％
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2％的三氟乙酸水溶液；所述植物原料的用量不超过1000mg或不超过200mg或不超过100mg；所述植物原料与提取溶剂的用量比为100mg：0.5
‑
5mL；所述提取包括涡旋混匀，超声，4℃下过夜放置并离心；具体的，所述超声中，时间为1
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60min；具体为2
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10min；超声功率为200
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300W；所述离心步骤中，离心转速为9000
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20000rpm；离心力为10000
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20000g；离心时间为10
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20min；所述混合型离子交换与反相保留吸附剂的Oasis固相萃取小柱选自混合模式强阳离子交换柱(Mixed
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Mode Strong Cation
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Exchange，MCX)、混合模式若阳离子交换柱(Mixed
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Mode Weak Cation
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Exchange，WCX)、混合模式强阴离子交换柱(Mixed
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Mode Strong Anion
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Exchange，MAX)和混合模式弱阴离子交换柱(Mixed
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Mode Weak Anion
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Exchange，WAX)中至少一种。4.根据权利要求1
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3任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)和步骤4)淋洗步骤中，淋洗溶剂为适用于反相与离子交换机理的洗脱溶剂。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：褚金芳，闫吉军，辛培勇，程淑静，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：