一种干细胞体外三维培养方法、药物组合物及其应用技术

本发明专利技术涉及一种干细胞体外三维培养方法、药物组合物及其应用，涉及组织工程修复与再生领域，所述干细胞体外三维培养方法为将间充质干细胞接种至成球培养基中进行培养，得到球形间充质干细胞；其中，所述成球培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为DMEM/F12培养基；所述添加物包括血清白蛋白和双抗P/S。本发明专利技术的血清白蛋白促进间充质干细胞形成的三维球形，简单方便，可大规模生产，且能够维持干细胞性能，在组织修复中得以应用。在组织修复中得以应用。在组织修复中得以应用。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞体外三维培养方法、药物组合物及其应用


[0001]本专利技术涉及组织工程修复与再生领域，具体涉及一种干细胞体外三维培养方法、药物组合物及其应用。

技术介绍

[0002]口腔黏膜缺损疾病是临床中的高发疾病，超过25％的年轻人患过口腔溃疡等粘膜疾病，临床上可表现为粘膜及固有层缺损，自觉烧灼感、疼痛，严重影响患者的生活质量。与外部皮肤缺损不同，口腔内的唾液以及饮食长期对粘膜形成刺激；此外，咀嚼、发音、吞咽，甚至面部表情的变化均可引起口腔黏膜的运动，进而加剧疼痛，并影响缺损愈合。潮湿、高度动态的环境使其治疗具有挑战性。传统使用的保护性材料和治疗性药物对其治疗效果欠佳，归咎于上述原因而使材料和药物在伤口处短暂的停留，不能长时间发挥作用。
[0003]近年来，干细胞在组织缺损修复中的应用越来越广泛。有研究人员利用仿生水凝胶承载二维培养的间充质干细胞，可快速实现伤口的修复与再生，其实质是利用水凝胶的三维网状结构，使间充质干细胞实现三维生长。间充质干细胞的三维培养可明显提高干细胞的增殖能力、抗凋亡、抗炎能力和旁分泌能力。但是采用仿生水凝胶承载的二维培养的间充质干细胞，培养过程复杂，成本高，很难实现大规模生产。
[0004]鉴于此，本专利技术提供一种干细胞体外三维培养方法、药物组合物及其应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种干细胞体外三维培养方法、药物组合物及其应用。提供一种成本低，简单方便，可大规模生的三维球形的间充质干细胞以及在组织修复中的应用。
[0006]本专利技术解决上述技术问题，本专利技术的第一个目的是提供一种间充质干细胞体外三维培养方法，所述干细胞体外三维培养方法为将间充质干细胞接种至成球培养基中进行培养，得到球形间充质干细胞；
[0007]其中，所述成球培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为DMEM/F12培养基；所述添加物包括血清白蛋白和双抗P/S(青链霉素混合液(100X)。
[0008]本专利技术的有益效果是：本专利技术的血清白蛋白促进间充质干细胞形成三维球形结构，其成本较低，简单方便，可大规模生产。
[0009]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
[0010]进一步，所述添加物包括质量浓度为1
‑
10％血清白蛋白和1％双抗P/S(青链霉素混合液(100X))。
[0011]采用上述进一步方案的有益效果是：含有质量浓度为1
‑
10％血清白蛋白和1％双抗P/S的DMEM/F12培养基更够更好的的促进间充质干细胞形成的三维球形。
[0012]进一步，所述间充质干细胞包括脂肪间充质干细胞(ADSCs)、骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞和胎盘间充质干细胞中的任一种；所述血清白蛋白
包括质量浓度为1％牛血清白蛋白(BSA)或1％人血清白蛋白。所述间充质干细胞可以通过商购的方式获得，或通过实验制备获得。
[0013]进一步，所述干细胞体外三维培养方法具体包括以下步骤：
[0014]用胰蛋白酶溶液将第P3
‑
P7代的间充质干细胞解离成单个细胞，离心、洗涤，用含有牛血清白蛋白和双抗P/S的DMEM/F12培养基重悬，后铺于细胞培养板中于37℃、5％CO2的孵箱中培养3～5d，得到球形间充质干细胞。
[0015]采用上述进一步方案的有益效果是：通过上述步骤培养使间充质干细胞形成的三维球形。
[0016]进一步，所述干细胞体外三维培养方法具体包括以下步骤：
[0017]用0.25wt％胰蛋白酶溶液将第P3
‑
P7代的脂肪间充质干细胞解离成单个细胞，离心，PBS洗涤2次，用质量浓度含有1
‑
10％牛血清白蛋白和1％双抗P/S的DMEM/F12培养基重悬，后铺于细胞培养板中于37℃、5％CO2的孵箱中培养3～5d，得到球形脂肪间充质干细胞。
[0018]采用上述进一步方案的有益效果是：通过上述步骤培养使脂肪间充质干细胞形成的三维球形。
[0019]本专利技术的第二个目的是提供一种药物组合物，包括上述所述一种间充质干细胞体外三维培养方法的制备得到的球形间充质干细胞。所述药物组合物中的活性成分(本专利技术的球形间充质干细胞)的实际剂量应根据多种相关因素来确定，包括待治疗的疾病严重程度、施用途径、患者年龄、性别、体重，因此，上述剂量不应以任何方式限制本专利技术的保护范围。
[0020]进一步，还包括药学上可接受的载体和/或辅料。所述药学上可接受的载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。
[0021]进一步，所述药物组合物的剂型包括片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、混悬剂和溶液剂中的至少一种。所述药物组合物为药学上可接受的任意剂型均可。所述药物组合物的适合给药剂量，根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗有效的给药剂量。
[0022]本专利技术的第三个目的是提供一种药物组合物的应用，所述药物组合物在组织修复和/或再生的药物中的应用。
[0023]进一步，所述组织修复为黏膜组织修复。除了口腔黏膜修复，还包括其他组织的修复，如皮肤黏膜的修复和再生。
[0024]专利技术首次发现了血清白蛋白(牛血清白蛋白或人血清白蛋白)可以促进间充质干细胞在体外形成三维球形，其成本较低，简单方便，可大规模生产。与二维细胞相比，球形间充质干细胞具有促进细胞增殖、使巨噬细胞向M2型发生表型转换，同时能够维持细胞活性。在动物模型中，利用SD大鼠口腔黏膜缺损模型，验证牛血清白蛋白促进人脂肪间充质干细胞形成的三维球形能够促进SD大鼠硬腭黏膜的修复和再生。因此可以应用于制备促进口腔黏膜缺损修复的药物，能够有效、长期的用于治疗口腔黏膜缺损相关疾病。
附图说明
[0025]图1为本专利技术第1至4天形成的脂肪干细胞球的形态光镜图；
[0026]图2为本专利技术球形脂肪干细胞的流式细胞术的鉴定图；
[0027]图3为本专利技术脂肪干细胞的增殖特性的CCK
‑
8图；
[0028]图4为本专利技术脂肪干细胞球的增殖相关基因表达检测图；*P<0.05，**P<0.01；误差线：平均值
±
标准差值(Means
±
SD)，A为表皮生长因子(EGF)的表达，B为胰岛素样生长因子(IGF1)的表达；
[0029]图5为本专利技术脂肪干细胞球的活死(合并)细胞染色图片，A为细胞染色图，B为活细胞的统计图；
[0030]图6为本专利技术脂肪干细胞球的巨噬细胞极化后相关基因表达检测图片；*P<0.05，**P<0.01；误差线：平均值
±
标准差值(Means本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞体外三维培养方法，其特征在于，所述干细胞体外三维培养方法为将间充质干细胞接种至成球培养基中进行培养，得到球形间充质干细胞；其中，所述成球培养基包括基础培养基和添加物，所述基础培养基为DMEM/F12培养基；所述添加物包括血清白蛋白和双抗P/S。2.根据权利要求1所述一种间充质干细胞体外三维培养方法，其特征在于，所述添加物包括质量浓度为1
‑
10％血清白蛋白和1％双抗P/S。3.根据权利要求1所述一种间充质干细胞体外三维培养方法，其特征在于，所述间充质干细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞和胎盘间充质干细胞中的任一种；所述血清白蛋白包括质量浓度为1
‑
10％牛血清白蛋白或1
‑
10％人血清白蛋白。4.根据权利要求3所述一种间充质干细胞体外三维培养方法，其特征在于，所述干细胞体外三维培养方法具体包括以下步骤：用胰蛋白酶溶液将第P3
‑
P7代的间充质干细胞解离成单个细胞，离心、洗涤，用含有牛血清白蛋白和双抗P/S的DMEM/F12培养基重悬，后铺于细胞培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋楠，王衣祥，张益，葛学军，吴晓文，赵雅君，
申请(专利权)人：北京大学口腔医学院，
类型：发明
国别省市：