一种粗毛纤孔菌的液体发酵培养方法及活性代谢产物技术

本发明专利技术提供了一种粗毛纤孔菌的液体发酵培养方法及活性代谢产物，液体发酵的培养基为麦芽糖，酵母粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、水；培养菌株斜面活化、平板培养、菌丝接种、菌丝分散和摇瓶发酵培养，所得到的粗毛纤孔菌发酵液经过滤分离、乙醇沉淀、离心分离、干燥，获得粗毛纤孔菌菌丝体、具有体外自由基清除活性的黄酮类物质和具有抑制肿瘤细胞体外增殖活性的胞外多糖。本发明专利技术添加麦麸对分散的菌丝进行吸附和稳定，避免菌丝贴壁生长，从而控制发酵过程中菌丝球的形态、大小和数量。利用本发明专利技术的方法可节省菌丝接种量、大幅度增加活性代谢产物的产量、大大提高发酵速度、减少发酵时间，从而降低生产成本。生产成本。生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种粗毛纤孔菌的液体发酵培养方法及活性代谢产物


[0001]本专利技术属于发酵工程
，具体地，涉及一种粗毛纤孔菌的液体发酵培养方法及活性代谢产物。

技术介绍

[0002]粗毛纤孔菌(Inonotus hispidus)属于担子菌门的纤孔菌属大型食药用真菌，它是唯一符合我国古籍中关于“桑黄”描述的菌种。“桑黄”的药用价值在我国中医典籍中早有记载，从东汉时期的《神农本草经》至明代李时珍所著的《本草纲目》。它不仅清热解毒，还能活血化瘀，同时对人体补虚益气的方面也有良好功效，可治经闭、血崩、血淋、气虚血虚等症。近些年，国内外研究分别发现野生或人工栽培粗毛纤孔菌其具有抗衰老、提高免疫力、抗病毒、降血脂、活血化瘀等广泛的生物活性，具有极高的医疗应用前景。但野生粗毛纤孔菌随着采集而逐渐减少，导致粗毛纤孔菌资源短缺，价格高昂；而人工栽培粗毛纤孔菌获得子实体的方法用时长，且对资源的消耗较大，所以液态发酵技术受到更多的关注。目前液体发酵的菌株是由野生菌株鉴定分离，不同的菌株存在较大的遗传差异，对培养基的选择和利用各有不同，导致发酵代谢产物种类、含量和活性差异巨大。因此，筛选高活力的粗毛纤孔菌菌株并对发酵条件进行优化调控对于其液体发酵工程非常关键。
[0003]粗毛纤孔菌属于丝状真菌，在液体发酵生产过程中，常采用琼脂块作为菌种接种。这种情况下，菌丝会呈现紧密的团块状并不断增大，在团块内部，营养物质及氧气传递受阻，会导致内部出现营养匮乏及缺氧状态，影响菌丝体生长和产物合成，有时还会造成团块内部菌丝体发生自溶现象。此外，菌丝易于依附着摇瓶的玻璃内壁向上攀附生长，导致其生长过程中对营养物质的利用有限且仅有少量活性产物分泌到液体培养液中。菌丝球团聚和贴壁生长的问题也发生在这株粗毛纤孔菌发酵培养阶段，这导致发酵周期长、产物代谢产量低、活性不高，因此需要对发酵条件和接种方式进行优化调控。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对现有技术存在的不足，旨在提供一种粗毛纤孔菌的液体发酵培养方法及活性代谢产物。
[0005]一种粗毛纤孔菌的液体发酵培养方法，包括以下步骤：
[0006]平板培养：将活化后的粗毛纤孔菌菌种接种至琼脂平板培养基(PDA)中培养；
[0007]培养基配制：碳源培养基配方：碳源5～20g/L，酵母浸粉5～20g/L，磷酸二氢钾0.5～5g/L，硫酸镁0.1～2g/L，氮源培养基配方：麦芽糖5～20g/L，氮源5～20g/L，磷酸二氢钾0.5～5g/L，硫酸镁0.1～3g/L；
[0008]菌丝分散：平板培养得到的琼脂块作为菌种，接种到上述碳源培养基和/或氮源培养基中，培养至菌丝球生成，对含有上述菌丝球的液体培养进行高速剪切破碎，最终得到含有分散菌丝的菌悬液；
[0009]菌丝接种与液体发酵培养：根据吸光值调整破碎后菌悬液的浓度，再将菌悬液接
种至上述培养基，并向其中加入麦麸得到接种后的培养液，进行液体发酵培养。
[0010]所述粗毛纤孔菌选自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC3.15188。
[0011]优选的，所述活化后的粗毛纤孔菌菌种通过以下方法得到：将麦芽汁培养基，与冻干菌粉混合，使冻干菌体溶解成悬浮状，然后将菌体悬液移植于固体培养基，挑选出生长茁壮的菌落，接种到新的固体培养基中培养，从而得到生长良好的菌种。其中固体培养基组成包括葡萄糖5～15g/L，蛋白胨5～15g/L，酵母浸粉1～10g/L,琼脂10～30g/L。
[0012]所述麦芽汁培养基的用量满足将冻干菌粉溶解即可。
[0013]优选的，平板培养步骤中，所述培养的条件为在22～28℃下避光培养8～10d。
[0014]优选的，培养基配制步骤中，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉中的至少一种，所述氮源为酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏、豆粉饼、尿素中的至少一种。
[0015]优选的，培养基配制步骤中，碳源培养基配方：碳源10～15g/L，酵母浸粉10～15g/L，磷酸二氢钾0.5～3g/L，硫酸镁0.1～1g/L；氮源培养基配方：麦芽糖5～15g/L，氮源5～15g/L，磷酸二氢钾0.5～3g/L，硫酸镁0.1～1g/L。
[0016]优选地，培养基配制完成后，进行高压灭菌，冷却至常温备用。
[0017]优选的，菌丝分散步骤中，所述琼脂块是于平板培养中菌落近边缘打孔，得到带有菌丝的琼脂块；
[0018]优选的，菌丝分散步骤中，培养的温度为25～35℃。
[0019]优选的，菌丝分散步骤中，所述高速剪切时所使用的高速剪切机工作强度为5～6；高速剪切机工作时间为60～120s。
[0020]优选的，菌丝接种与液体发酵培养步骤中，所述调整后的菌悬液吸光值为0.3～0.5，更优选为0.35～0.5；若吸光值过大测需要稀释原始菌悬液后再进行接种。
[0021]优选的，菌丝接种与液体发酵培养步骤中，所述的菌悬液接种量为0.5～1％。
[0022]优选的，菌丝接种与液体发酵培养步骤中，所用麦麸经过粉碎过筛，最终的粒径为30～50目。优选地，所用麦麸经过三次的水洗烘干处理以除去可溶性物质。
[0023]优选的，菌丝接种与液体发酵培养步骤中，培养液中麦麸的添加量为6～10g/L，更优选为8～10g/L。
[0024]优选的，菌丝接种与液体发酵培养步骤中，所述液体发酵培养是将得到的接种后的培养液在培养8
‑
15d。
[0025]微生物细胞中的碳元素含量相当高，一般能达到菌体干重的50％左右，是菌体生长主要原材料之一，同时也是微生物代谢的主要能量来源。微生物对碳源的利用与其自身具有的酶系与代谢过程息息相关。葡萄糖虽广泛应用于发酵生产中,但葡萄糖作为速效碳源可能会抑制产物的形成，而像乳糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉等缓慢利用的碳源可能会更适合产物的生产。与碳源类似，氮源在微生物的生长过程中也起到构成细胞结构和提供细胞生长所需要能量的作用，主要有有机氮源和无机氮源，两者在发酵过程中的性质具有较大的差异。无机氮源属于速效氮源成分较为单一，易被菌体吸收。有机氮源成分复杂，营养丰富，含有蛋白质，肽类，游离氨基酸等，常见的有机氮源有牛肉粉、蛋白胨、酵母粉等。有机氮源要被微生物分泌的蛋白酶水解后方能被吸收，进一步开始分解代谢。因此选择合适的碳源和氮源对菌丝体的生长和代谢产物积累尤为重要。
[0026]丝状真菌的液体菌种制备通常先将菌种活化，再转至平板培养，待菌落长好后用
打孔器于培养菌落近边缘打孔，挑取琼脂块进行液体培养。而琼脂块作为接种种子时生长点极少，致使菌丝不断围绕琼脂块向外生长，形成较大的致密菌丝球。在球块内部，营养物质及氧气传递受阻，会导致内部出现营养匮乏及缺氧状态，影响菌丝体生长和产物合成，有时还会造成球块内部菌丝体发生自溶现象。此外，琼脂块之间存在一定的生长差异，难于准确控制接种量与菌种状态。为提高液体菌种生长点、便于接种以及准确控制接种量，采用物理破碎的方法可以获得大量微小的菌丝进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种粗毛纤孔菌的液体发酵培养方法，包括以下步骤：平板培养：将活化后的粗毛纤孔菌菌种接种至琼脂平板培养基中培养；培养基配制：碳源培养基配方：碳源5～20g/L，酵母浸粉5～20g/L，磷酸二氢钾0.5～5g/L，硫酸镁0.1～2g/L，氮源培养基配方：麦芽糖5～20g/L，氮源5～20g/L，磷酸二氢钾0.5～5g/L，硫酸镁0.1～3g/L；菌丝分散：平板培养得到的琼脂块作为菌种，接种到上述碳源培养基和/或氮源培养基中，培养至菌丝球生成，对含有上述菌丝球的液体培养进行高速剪切破碎，最终得到含有分散菌丝的菌悬液；菌丝接种与液体发酵培养：根据吸光值调整破碎后菌悬液的浓度，再将菌悬液接种至上述培养基，并向其中加入麦麸得到接种后的培养液，进行液体发酵培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述粗毛纤孔菌选自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC3.15188；菌丝接种与液体发酵培养步骤中，培养液中麦麸的添加量为6～10g/L。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：培养基配制步骤中，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉中的至少一种，所述氮源为酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏、豆粉饼、尿素中的至少一种。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：培养基配制步骤中，碳源培养基配方：碳源10～15g/...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兆梅，季杏迪，刘丽艳，沈珂，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：