一种高效培养丛枝菌根真菌的方法技术

本发明专利技术涉及一种高效培养丛枝菌根真菌的方法，属于微生物学技术领域。本发明专利技术提供一种丛枝菌根真菌培养基，所述培养基包含肉豆蔻酸钾。本发明专利技术通过在培养基中加入一定浓度的肉豆蔻酸钾，可以直接刺激亲代AMF孢子的萌发并产生更多的分枝状结构，且能够提高孢子密度；本发明专利技术把肉豆蔻酸钾在AMF纯培养领域的应用与大容量的双室分隔系统相结合，可在传统平板体系的基础上获得更高质量的AMF菌丝和孢子，且扩繁效率明显提高；本技术方案的操作步骤简单，可在同样的培养周期下获取孢子密度更高且无杂菌污染的菌剂，在AMF机理方面的研究领域具有广泛的应用前景。有广泛的应用前景。有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种高效培养丛枝菌根真菌的方法


[0001]本专利技术涉及一种高效培养丛枝菌根真菌的方法，属于微生物学


技术介绍

[0002]丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)是一种在自然界分布广泛且具有重要生态功能的关键微生物类群之一，能够与近80％的陆生植物形成菌根共生体。通过与AMF共生进行养分交易，宿主植物可以利用其庞大的菌丝网络扩大与土壤的接触范围，从而促进根系对N、P等营养元素的吸收，同时还能够提高自身应对干旱、重金属等环境胁迫的抗性。而作为回报，宿主植物会向AMF提供糖类、脂肪酸等碳源供其生长发育。因此AMF被认为是农、林与生态修复等领域最具应用前景的微生物类群。
[0003]AMF培养技术的开发与优化是推动AMF研究进程以及实现AMF大规模应用的重要环节。已有的研究证实，AMF缺乏脂肪酸合成酶，无法自行从头合成脂肪酸，在自然环境下必须通过与宿主植物共生并从宿主根系获取包括脂肪酸在内的碳源才能完成生活史，属于严格营专性共生的脂肪酸营养缺陷型微生物，无法在脱离宿主条件下实现“纯培养”。这是限制AMF的科学研究以及大规模应用的关键因素。目前AMF的扩繁技术主要采用以沙、土等为载体、与典型AMF宿主植物(如三叶草、苜蓿等)共培养的方式(即盆钵培养法)；该方法操作相对简单，对于推动AMF的研究和应用发挥了重要作用。但通过该方法获得的AMF培养物中除AMF孢子、菌丝以外还同时包括沙、土、植物根系以及其他土壤微生物，难以获得无杂菌污染的AMF孢子和菌丝。此外，该方法存在
①
扩繁周期较长且需要长期维护(要获得大量AMF繁殖体需要将植物在特定条件下培养4个月左右)；
②
扩繁体系稳定性较差(如当宿主植物遇到病虫害时，AMF繁殖体的产量会随之下降)；
③
培养条件要求高(需要控温控湿且带有光照节律控制的植物培养房)等问题。这些不足严重限制了对AMF的深入研究，也不利于AMF大规模生产和应用时的质量控制(如土壤微生物中可能包含有害微生物)。毛状根培养是20世纪80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术，通过将发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)中Ri质粒含有的T
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DNA整合到植物细胞的DNA上，诱导植物细胞产生毛状根。通过构建毛状根与AMF的单一共培养体系，使获得无杂菌污染的纯净AMF菌丝、孢子成为可能。该体系具有稳定且易于扩繁、观察及维护等优点，现已成为制备新型AMF菌剂、保种培育及研究AMF生理和分子机制的重要技术。但隔绝外界污染、条件单一的毛状根
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AMF共培养体系在实际应用中面临一下难题：
①
毛状根的养分来自培养基，而AMF则同时从毛状根和培养基中获取养分，存在AMF与毛状根的养分竞争；
②
生长速率较为缓慢，依据培养条件和AMF种类通常需要3个月以上；
③
AMF菌丝和孢子的产量较低。因此，优化单一共培养体系以提高孢子的扩繁效率和产量在AMF的研究和应用领域具有重要价值。
[0004]双室分隔系统多为一般研究中用于限制AMF生长的常用手段，以双室分隔系统为培养条件可限制宿主植物根系的伸展范围，从而强化AMF与宿主植物的共生效应。但该系统目前多被用在盆栽实验或二分室平板中，目前未见用于构建AMF菌剂的分室培养体系。无宿主AMF可以利用人为施加的外源脂肪酸在脱离宿主的条件下实现一定程度的非共生生长。
其中，
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C标记试验证实脂肪酸中的碳被用于合成AMF的结构。但该技术尚未发展成熟，所获得的AMF子代孢子直径只能达到母孢子水平的二分之一，其与宿主植物的共生程度和促生效果均低于共生培养的AMF孢子。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种高效培养丛枝菌根真菌的方法，本专利技术采用含一定浓度肉豆蔻酸钾的双室分隔系统对毛状根与AMF进行共培养，肉豆蔻酸钾能够提高体系中AMF的生长速率，双室系统能够大幅提高AMF的产量。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种丛枝菌根真菌培养基，所述培养基包括肉豆蔻酸钾。
[0007]研究表明，自然环境下的AMF属于严格营专性共生生长的土壤微生物，其对宿主植物碳源的依赖性决定了其难以实现纯培养的的特殊性；非共生培养条件下脂肪酸的添加在一定程度上补充了部分AMF碳源，但是AMF在生长发育过程中仍然缺乏某些未知的养分及/或信号物质，导致AMF生长缓慢且获得的AMF孢子其侵染效率和植物促生效果低于共生培养条件下获得的的AMF孢子，难以实现AMF菌剂的高效生产。本申请专利技术人经过大量的实验发现，在培养基中添加肉豆蔻酸钾作为诱导AMF生长分支的刺激物质与额外碳源，一方面，克服了非共生AMF培养条件下AMF生长缓慢、且获得的AMF孢子直径低于共生培养获得的AMF孢子、侵染程度和植物促生效果低的不足，另一方面，克服了传统单一共培养平板体系中，由于AMF专性共生的特殊性，繁殖周期长的问题，可在较大程度上提高菌剂的扩繁速率(双室分隔系统的培养耗时与平板相比降低了30％)。
[0008]作为本专利技术所述的丛枝菌根真菌培养基的优选实施方式，所述培养基中肉豆蔻酸钾的浓度为0.1～5mM。本专利技术研究发现，当培养基中肉豆蔻酸钾的浓度为0.1～5mM，其对AMF孢子萌发以及生长有很好的促进作用。
[0009]本专利技术还提供所述的丛枝菌根真菌培养基在制备丛枝菌根真菌菌剂中的应用。
[0010]本专利技术还提供一种培养丛枝菌根真菌的方法，采用双室分隔培养罐进行培养，具体包括以下步骤：
[0011]S1：在培养罐中加入所述的丛枝菌根真菌培养基；
[0012]S2：培养扩繁亲代丛枝菌根真菌
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毛状根菌剂；
[0013]S3：将S2中的亲代丛枝菌根真菌
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毛状根菌剂移种至双室分隔培养罐的一室中培养；
[0014]S4：采用柠檬酸钠溶液对培养基进行溶解，抽滤、定容得悬浮液。
[0015]本专利技术研究发现，将肉豆蔻酸钾在AMF纯培养领域的应用与大容量的双室分隔系统相结合，可在传统平板体系的基础上获得更高质量的AMF菌丝和孢子，且扩繁效率明显提高。
[0016]作为本专利技术所述的培养丛枝菌根真菌的方法的优选实施方式，所述双室分隔培养罐中间设置有孔径为35～38μm的分隔网。
[0017]作为本专利技术所述的培养丛枝菌根真菌的方法的优选实施方式，所述分隔网的高度为培养罐深度的1/2～2/3。
[0018]作为本专利技术所述的培养丛枝菌根真菌的方法的优选实施方式，所述S1中培养罐加
入丛枝菌根真菌培养基后还进行高压灭菌。
[0019]作为本专利技术所述的培养丛枝菌根真菌的方法的优选实施方式，所述S2中的丛枝菌根真菌包括异形根孢囊霉或根内根孢囊霉。
[0020]作为本专利技术所述的培养丛枝菌根真菌的方法的优选实施方式，所述S3中的培养条件为：25℃避光培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种丛枝菌根真菌培养基，其特征在于，所述培养基包含肉豆蔻酸钾。2.根据权利要求1所述的丛枝菌根真菌培养基，其特征在于，所述培养基中肉豆蔻酸钾的浓度为0.1～5mM。3.根据权利要求1～2任一项所述的丛枝菌根真菌培养基在制备丛枝菌根真菌中的应用。4.一种培养丛枝菌根真菌的方法，其特征在于，采用双室分隔培养罐进行培养，具体包括以下步骤：S1：在培养罐中加入权利要求1～2任一项所述的丛枝菌根真菌培养基；S2：培养扩繁亲代丛枝菌根真菌
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毛状根菌剂；S3：将S2中的亲代丛枝菌根真菌
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毛状根菌剂移种至双室分隔培养罐的一室中培养；S4：采用柠檬酸钠溶液对培养基进行溶解，抽滤、定容得悬浮液。5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宇涛，熊天，关宝兴，吴靖雯，陈瀚文，束文圣，李金天，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：