使用多核苷酸沉默和替换的神经退行性病症的基因疗法制造技术

本公开涉及用于治疗神经退行性病症的核酸表达盒和载体。还提供了治疗神经退行性病症如阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆、额颞叶变性、匹克氏病、路易体痴呆、记忆丧失、认知损害和轻度认知损害的方法。认知损害的方法。认知损害的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用多核苷酸沉默和替换的神经退行性病症的基因疗法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35U.S.C.
§
119(e)要求2020年1月31日提交的美国临时申请号62/968,707的优先权权益，所述临时申请的全部内容以引用方式整体并入本文。
[0003]序列表的并入
[0004]随附序列表中的材料特此以引用方式并入本申请。命名为APRES1120_1WO_Sequence_Listing.txt的随附序列表文本文件创建于2021年1月29日并且大小为194,755字节。可以在使用Windows OS的计算机上使用Microsoft Word访问该文件。


[0005]本公开一般涉及神经退行性病症的基因疗法，并且更具体地涉及用于递送治疗剂的表达盒和多核苷酸。

技术介绍

[0006]阿尔茨海默氏病(Alzheimer
’
s disease，AD)，也称为阿尔茨海默氏病(Alzheimer
’
s)，是一种慢性神经退行性疾病，它是大多数神经退行性痴呆的原因。症状包括记忆困难、语言问题、定向障碍、情绪波动、失去动力，以及其他行为问题，如远离家庭和社会。身体机能逐渐丧失，最终导致死亡。虽然该疾病可以持续十年以上，但平均预期寿命是诊断后的三到九年。家族性AD(FAD)的特征是具有不止一名AD成员的家庭，并且通常意味着不止一代人中有多个受影响的人。早发型FAD(EOFAD)是指持续在60至65岁之前并且通常在55岁之前发病的家庭。
[0007]AD在病理学上表现为脑中的细胞外淀粉样蛋白斑块和细胞内神经原纤维缠结。尽管大多数AD病例的原因尚不清楚，但遗传因素有助于疾病的发展。早发型家族性AD的特征是常染色体显性遗传和在65岁之前发病。
[0008]需要用于治疗神经退行性疾病如AD的组合物和方法，包括有效的基因和联合疗法。

技术实现思路

[0009]本公开涉及用于治疗神经退行性病症的多核苷酸、表达盒以及包含此类多核苷酸和/或表达盒的载体。更具体地，本公开中使用的多核苷酸、表达盒和载体包含a)第一多核苷酸序列，其编码一个或多个短发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(miRNA)，所述RNA与由内源性早老素1(PSEN1)或早老素2(PSEN2)基因表达的mRNA具有足够的序列互补性，以与所述mRNA杂交并抑制所编码的早老素1(PSEN1)或早老素2(PSEN2)蛋白或其组合的表达，以及b)第二多核苷酸序列，其编码野生型PSEN1或PSEN2蛋白，或其组合。与内源性控制序列相反，由第二多核苷酸编码的野生型PSEN1或PSEN2是利用表达盒和/或携带它们的载体中存在的控制序列表达的。由第二多核苷酸序列表达的mRNA必须能够抵抗通过第一多核苷酸序列编码的短发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(miRNA)实现的阻抑。因此，野生型PSEN1或PSEN2蛋白的同
时表达导致内源性表达的PSEN1或PSEN2蛋白的替换。
[0010]早老素可以携带导致常染色体显性获得性毒性功能的突变。此类突变分布在PSEN1及其同源物PSEN2的整个编码序列中。同时阻抑常染色体显性突变早老素并表达野生型基因的能力消除了对专门靶向突变等位基因的需要。因此，本公开的多核苷酸、表达盒和载体，以及使用它们的本公开的组合物和方法可用于停止和/或改善与突变PSEN1或PSEN2或其组合相关的损伤。
[0011]替换野生型PSEN1或PSEN2避免被一个或多个shRNA或miRNA靶向和阻抑的能力将取决于shRNA或miRNA所靶向的PSEN1或PSEN2 mRNA序列上的位置以及替换野生型PSEN1或PSEN2编码序列中使用的密码子。如果所设计的所有shRNA或miRNA都靶向内源性PSEN1或PSEN2 mRNA的非编码区，则替换PSEN1或PSEN2多核苷酸序列可以是编码野生型PSEN1或PSEN2的任何序列，包括但不限于内源性人PSEN1或PSEN2编码序列，或其中一些或所有密码子基于遗传密码子的冗余性被改变以增加表达的序列，例如，完全或部分密码子优化的野生型PSEN1或PSEN2多核苷酸序列。如果一些或所有shRNA或miRNA靶向内源性PSEN1或PSEN2 mRNA的编码区，则必须对替换PSEN1或PSEN2多核苷酸序列中的相应编码区进行修饰，使得所表达的mRNA不被shRNA或miRNA中的任一个靶向。这通过使用遗传密码子的冗余性修饰内源性密码子以降低所表达的mRNA与shRNA或miRNA序列的同源性/互补性来实现。
[0012]在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸、表达盒、载体、组合物和方法可用于阻抑内源性PSEN1蛋白，同时增加野生型PSEN1蛋白的水平。内源性PSEN1蛋白的阻抑通常通过使用一种或多种反义寡核苷酸来实现，所述反义寡核苷酸与由内源性PSEN1基因表达的mRNA结合，从而降低此类mRNA的水平和/或抑制其翻译成蛋白质。在这些实施方案的一些方面，反义寡核苷酸是由作为表达盒或载体的一部分施用于受试者的DNA序列编码的反义RNA。这样的反义RNA包括shRNA、miRNA或单链反义RNA。在这些实施方案的替代方面，将反义寡核苷酸直接递送至受试者。此类反义寡核苷酸包括siRNA、反义DNA寡核苷酸、外部引导序列寡核苷酸以及可变剪接体寡核苷酸。在这些实施方案的一些方面，提供了一种无毒的双功能载体，其能够表达反义RNA和野生型PSEN1，所述野生型PSEN1的表达不受反义RNA的阻抑。在一些实施方案中，反义寡核苷酸与编码野生型PSEN1的载体同时施用，所述野生型PSEN1的表达不受所提供的反义寡核苷酸的阻抑。在这些实施方案的其他方面，包含编码反义RNA的DNA序列的第一载体与包含编码野生型PSEN1的DNA序列的第二载体同时施用，所述野生型PSEN1的表达不受反义RNA的阻抑。
[0013]在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸、表达盒、载体、组合物和方法可用于阻抑内源性PSEN2蛋白，同时增加野生型PSEN2的水平。内源性PSEN2蛋白的阻抑通常通过使用一种或多种反义寡核苷酸来实现，所述反义寡核苷酸与由内源性PSEN2基因表达的mRNA结合，从而降低此类mRNA的水平和/或抑制其翻译成蛋白质。在这些实施方案的一些方面，反义寡核苷酸是由作为表达盒或载体的一部分施用于受试者的DNA序列编码的反义RNA。这样的反义RNA包括shRNA、miRNA或单链反义RNA。在这些实施方案的替代方面，将反义寡核苷酸直接递送至受试者。此类反义寡核苷酸包括siRNA、反义DNA寡核苷酸、外部引导序列寡核苷酸以及可变剪接体寡核苷酸。在这些实施方案的一些方面，提供了一种无毒的双功能载体，其能够表达反义RNA和野生型PSEN2，所述野生型PSEN2的表达不受反义RNA的阻抑。在一些实施方案中，反义寡核苷酸与编码野生型PSEN2的载体同时施用，所述野生型PSEN2的表达
不受所提供的反义寡核苷酸的阻抑。在这些实施方案的其他方面，包含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】NO:39相比密码子优化或修饰的多核苷酸。7.如权利要求6所述的表达盒，其中所述第二多核苷酸序列包含SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:48，或SEQ ID NO:68的核苷酸1906
‑
3303。8.如权利要求4所述的表达盒，其中至少一个shRNA或miRNA包含以下中的一个：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:68的核苷酸497
‑
517、SEQ ID NO:69的核苷酸497
‑
517、SEQ ID NO:70的核苷酸497
‑
517、SEQ ID NO:71的核苷酸497
‑
517。9.如权利要求8所述的表达盒，其中所述第二多核苷酸包含与SEQ ID NO:39相比密码子修饰的多核苷酸。10.如权利要求9所述的表达盒，其中所述第二多核苷酸序列包含SEQ ID NO:41，或SEQ ID NO:68的核苷酸1906
‑
3303。11.如权利要求1
‑
10中任一项所述的表达盒，其中所述一个或多个第一启动子中的至少一个是RNA聚合酶II或III启动子。12.如权利要求11所述的表达盒，其中所述一个或多个第一启动子中的每一个是RNA聚合酶II或III启动子。13.如权利要求11或12所述的表达盒，其中所述RNA聚合酶III启动子是U6启动子、U61启动子、U69启动子、H1启动子或其任何组合；并且所述RNA聚合酶II启动子是遍在或神经元特异性启动子。14.如权利要求1
‑
13中任一项所述的表达盒，其中所述第二启动子是RNA聚合酶II启动子。15.如权利要求14所述的表达盒，其中所述RNA聚合酶II启动子是遍在或神经元特异性启动子。16.一种载体，其包含如权利要求1
‑
15中任一项所述的表达盒。17.一种载体组，其包括：a.包含含有第一多核苷酸的表达盒的第一载体，所述第一多核苷酸编码靶向由人野生型和突变型早老素1(PSEN1)中的每一者或由人野生型和突变型早老素2(PSEN2)中的每一者翻译的mRNA的编码区或非编码区的一个或多个shRNA或miRNA，其中所述一个或多个shRNA或miRNA中的每一个可操作地连接至一个或多个第一启动子；以及b.包含第二多核苷酸的第二载体，所述第二多核苷酸编码野生型早老素1(PSEN1)氨基酸序列或野生型早老素2(PSEN2)氨基酸序列，其中所述第二多核...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：帕罗斯生物公司，
类型：发明
国别省市：