一种羔羊皱胃活性成分的纯化及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种羔羊皱胃活性成分的纯化及其应用，该方法取新鲜羔羊第四胃，经冷冻，剪碎，冷冻干燥，液氮粉碎，即得羔羊第四胃粉末，用磁力搅拌法石油醚脱脂得到羔羊第四胃脱脂粉末，在用含丝氨酸酶抑制剂和二乙胺四乙酸和NaCl的磷酸缓溶液搅拌，经离心，透析，冷冻干燥得到的提取物，再经阴离子交换树脂分离纯化，脱盐，凝胶柱分离纯化，冷冻干燥得到高纯度的化合物YGP

【技术实现步骤摘要】
一种羔羊皱胃活性成分的纯化及其应用


[0001]本专利技术涉及一种羔羊皱胃活性成分的纯化及其应用。

技术介绍

[0002]糖蛋白(glycoprotein)是由寡糖链和多肽链共价链接而形成的复合大分子，广泛存在与动植物和微生物中。天然来源糖蛋白具调节免疫、抑制肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、抗疲劳、抗辐射等活性，有显著的药用功效和保健功能。目前，用于临床并具有高效免疫活性的药用蛋白制剂大多都是糖蛋白，其功能多样性也是目前糖生物学研究最活跃的领域。
[0003]羔羊皱胃是羔羊胃消化系统中唯一的具有化学和酶消化功能的胃，含有10余种分泌细胞，含有丰富的糖蛋白。羔羊皱胃不仅是药食兼用传统药材，而且现代临床药用历史可以追溯到上世纪的60年代。羔羊皱胃对治疗慢性胃炎和消化不良症药效突出，价格低廉，一直都是消化到疾病治疗和相关活性成分研究的热点。但所记载的现有关键技术只研究了其中凝乳酶和胃蛋白酶等消化酶，抗氧化活性多肽蛋白，益生菌活性糖蛋白等活性成分，并报道原料和总提取物具有治疗慢性胃炎和消化不良的药效。而基于其临床药效和现有技术没有关于其中抗炎和抗肿瘤相关化学成分的报道。既有必要研究羔羊皱胃中抗炎抗肿瘤活性成分并对其进行全面的结构表征，阐释其药效成分。
[0004]以糖蛋白作为关键词检索得到88篇从天然原料中获得糖蛋白的有关文件，其中提取方法和分离纯化方法14篇。
[0005]专利申请号202110922724.1以羔羊皱胃为原料提取了益生菌活性糖蛋白，申请号为202111360384.4是用天山马鹿的皱胃作为原料提取了透明质酸酶抑制活性糖蛋白，该两份申请都是本课题的前期研究，申请号202110922724.1用羔羊皱胃为原料获得益生菌活性糖蛋白，是在温度60℃高温条件下超声辅助提取法提取，乙醇沉淀和savage试剂脱蛋白后得到糖蛋白，得率为13.8％。申请号为202111360384.4是在室温条件下以氯化钠作为提取剂提取糖蛋白。
[0006]本专利技术是在本课题前期工作的基础上的进一步研究，两者的区别在于：本专利技术的提取方法在温度25
‑
40℃，含0.1Mm
‑
1mM的丝氨酸蛋白酶抑制剂和5mM二乙胺四乙酸和0.4
‑
0.6的氯化钠pH的磷酸缓冲液中磁力搅拌提取，磷酸缓冲液可以保持提取液pH的稳定性，避免溶液pH骤变引起的蛋白质变性，丝氨酸算蛋白酶抑制剂和二乙胺四乙酸是常用的酶抑制剂和金属离螯合剂，可以避免溶液中的活性蛋白和糖蛋白等成分在提取过程中被降解或失活；温度25
‑
40℃的提取是接近正常生理温度的温和条件有利于原料中的活性成分充分溶出和保留稳定的构型，合理的增大氯化钠的浓度可以增大原料中活性的提取率，因为蛋白质及衍生物在一定浓度范围内盐浓度越高溶解度越高，而大于合理范围后蛋白质和衍生物的溶解性反而降低，糖蛋白的亲水性相比于蛋白质高，因此较低的盐溶液中液可以有效提取糖蛋白；其次，本专利技术的羔羊皱胃糖蛋白活性成分并列产物，动物体内大部分糖蛋白以蛋白链为主要骨架完整糖蛋白中占比较高，而蛋白质在有机试剂中容易失去结构稳定性导致
失活；本专利技术得到高纯度的糖蛋白只用了DEAE
‑
52阴离子交换树脂和SaphadexG
‑
50分离纯化两个步骤就得到了高纯度的糖蛋白，且所使用的仪器和填料相对于HPLC仪器和柱子陈本低，制备方法具有易放大，重复性高，产率高，成本低，无污染的特点。
[0007]经大量检索：申请号为202111360384.4，201110138032.4，201110403339.2，200910089580.5，201110363289.X，201410129587.6，201610645106.6，201110363289.X，201310194864.7，201611261450.1，201810701088.1，201810982435.9，201811300319.0，201811300319.0，202110562376.1，202111360384.4等等文件中几乎所有的天然来源糖蛋白相关专利及文章中都使用了三氯乙酸脱蛋白，丙酮沉淀，乙醇沉淀，savage试剂脱蛋白等方法的一种或两种脱蛋白处理提取物后得到的产物才被定义为糖蛋白蛋白部位。
[0008]在申请号为202110562376.1中随然使用了二乙胺四乙酸(EDTA)但其实用量较高，80mM到120mM的EDTA被用作提取剂，所使用的浓度目的是从原料中提取EDTA溶解性的钙结合糖蛋白，因此使用的目的决定了浓度，进而决定了所得到的产物的不同；在上述检索的文件中都使用了DEAE
‑
52和Sephadex G系列填料对糖蛋白进行了分离纯化；在纯化过程中所使用的缓冲液和缓冲溶液的浓度，缓冲溶液的pH以及所使用的盐浓度等都是根据原料中糖蛋白的特性而选择。
[0009]而本专利技术的创新点在于，在提取到凝胶柱纯化的前一步都使用了丝氨酸酶抑制剂和EDTA，所使用EDTA浓度为5mM，目的使防止活性成分于重金属结合而导致的失活，更好的保留了其活性，更有合理性和高效性。

技术实现思路

[0010]本专利技术目的在于，提供一种羔羊皱胃活性成分的纯化及其应用，该方法取新鲜羔羊第四胃，经冷冻，剪碎，冷冻干燥，液氮粉碎，即得羔羊第四胃粉末，用磁力搅拌，石油醚脱脂得到羔羊第四胃脱脂粉末，在用NaCl的磷酸缓溶液搅拌提取糖蛋白，经离心，透析，冷冻干燥得到的提取物，再经阴离子交换树脂分离纯化，脱盐，凝胶柱分离纯化，冷冻干燥得到高纯度的化合物YGP
‑
1,YGP
‑
2,YGP
‑
3,YGP
‑
4糖蛋白。四种化合物的抗炎活性结果显示，YGP
‑
1,YGP
‑
2,YGP
‑
3,YGP
‑
4都显示了较强的COX
‑
2酶抑制活性,IC50值分别为18.45
±
0.679μg/mL，17.64
±
1.25μg/mL，16.14
±
1.11μg/mL，65.10
±
11.57μg/mL；而只有YGP
‑
2具有显著的LOX
‑
15酶抑制活性，其IC
50
值为2.79
±
0.05μg/mL大于阳性对照槲皮素的IC
50
值6.67
±
0.22μg/mL；对人结肠癌细胞HT
‑
29的抑制活性结果显示，YGP
‑
2，YGP
‑
3，YGP
‑
4的EC
50
分别为164.4
±
15.7μg/mL，19.9
±
1.46μg/mL和184.9
±
5.6μg/mL；对正常人肝细胞L02的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羔羊皱胃活性成分的纯化，其特征在于按下列步骤进行：a、取新鲜羔羊第四胃，用自来水清洗胃腔内容物，剥除脂肪及结缔组织，于温度
‑
80℃下冷冻3h，剪碎，冷冻干燥，液氮粉碎，即得羔羊第四胃粉末；b、将步骤a所得羔羊第四胃粉末用磁力搅拌，石油醚脱脂3次，得到羔羊第四胃脱脂粉末，并于温度
‑
20℃下冷冻保存；c、将步骤b所得羔羊胃脱脂粉末以料液比24
‑
36mL/ g，在温度20
‑
45℃，pH值7.0，浓度50 mM的磷酸缓冲液中提取1.5
‑
2.5h，其中磷酸缓冲液中含0.1
‑
1mM的丝氨酸酶抑制剂、5mM乙二胺四乙酸和0.4
‑
0.6 M的氯化钠；d、将步骤c所得到的提取液在10000转/分下离心10分钟，得到提取液；e、将步骤d得到的提取液用透析袋透析脱盐60 小时，冷冻干燥，得到羔羊皱胃提取物，称重计算提取率，于温度
‑
20℃保存；羔羊皱胃活性成分提取物的离子交换树脂分离纯化：f、将步骤d中得到的提取液以含0.1
‑
1mM的丝氨酸酶抑制剂和5mM乙二胺四乙酸的浓度50 mM的磷酸缓冲液，pH值为7.0为透析外液，用透析袋透析60h；g、将步骤f中得到的透析后的提取物用步骤f的缓冲液稀释至800 mL，上样到pH值为7.0的含0.1
‑
1mM的丝氨酸酶抑制剂、5mM乙二胺四乙酸的浓度50 mM的磷酸缓冲溶液预平衡的DEAE
‑
52阴离子交换树脂，再依次用相同缓冲液及浓度0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.8 M的NaCl溶液洗脱柱子，洗脱液在紫外280 nm测蛋白质洗脱曲线，用苯酚硫酸法在紫外490 nm处测定糖洗脱曲线；h、将步骤g中浓度0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.8 M的NaCl洗脱部位分别用透析袋透析脱盐60 h后，分别冷冻干燥，称重，依次命名为F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8于温度
‑ꢀ
20℃保存；i、将步骤h中得到的F1, F2, F3, ...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿布力米提，
申请(专利权)人：中国科学院新疆理化技术研究所，
类型：发明
国别省市：