一种检测IL-33的诊断试剂盒及制备和检测方法技术

本发明专利技术公开的是一种检测IL

【技术实现步骤摘要】
一种检测IL
‑
33的诊断试剂盒及制备和检测方法


[0001]本专利技术涉及一种试剂盒及制备和检测方法，更具体一点说，涉及一种检测IL
‑
33的诊断试剂盒及制备和检测方法，属于免疫检测分析


技术介绍

[0002]白细胞介素33(Interleukin 33)是IL
‑
1家族的一种促炎蛋白和染色质相关细胞因子，与IL
‑
1和IL
‑
18具有高度序列和结构相似性，组成性表达于内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞等非造血细胞上。IL
‑
33已被证实在病毒感染、自身免疫病、伤口愈合和纤维化中发挥重要作用。IL
‑
33不仅可以作为促炎因子调动机体的免疫应答，还能募集激活免疫抑制性细胞，调节机体免疫，维持免疫系统稳态。细胞处于应激状态时，定位于细胞核中的IL
‑
33会被释放并与肥大细胞相互作用，促进其分泌巨噬细胞募集因子，提高MHC I、MHC II类分子和肿瘤坏死因子TNF
‑
α的表达。在一些结直肠癌、乳腺癌和非小细胞肺癌的患者中，IL
‑
33的表达量明显升高，且与这些肿瘤的恶性程度密切相关，因此利用IL
‑
33可作为诊断试剂盒的研究方向，研发兼具灵敏度高、特异性强、稳定性好、可测定范围宽、试剂有效期长、操作简单等优势的检测IL
‑
33的时间分辨免疫荧光诊断试剂盒及其制备方法和检测方法是必然的趋势。
专利
技术实现思路

[0003]为了解决上述现有技术问题，本专利技术提供具有兼具灵敏度高、特异性强、稳定性好、可测定范围宽、试剂有效期长、操作简单等技术特点的一种检测IL
‑
33的诊断试剂盒及制备和检测方法。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0005]本专利技术一种检测IL
‑
33的诊断试剂盒的制备方法，该制备方法包括下述步骤:
[0006]1)制备预处理包被反应板：
[0007]使用白色聚苯乙烯制备板架，预留与酶标板相互配合的通孔；酶标板与板架配合组装，获得预处理包被反应板，备用；
[0008]2)包被板的获得：
[0009]用反应缓冲液将抗IL
‑
33单抗稀释至1
‑
4μg/mL，以100μL/孔包被过夜，然后洗涤、封闭、干燥，将微孔板真空密封于铝箔袋内，冷藏备用；
[0010]3)制备镧系元素离子标记的抗IL
‑
33单抗：
[0011]取IL
‑
33抗体1mg，经PD
‑
10转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na2CO3‑
NaHCO3缓冲液，获得浓缩至2g/L的IL
‑
33抗体溶液；取所述IL
‑
33抗体溶液500μL加入0.2mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，25℃下振荡反应20小时，将反应液转移到预先用pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的Sephadex G
‑
50柱上进行层析，收集蛋白峰，稀释，进行分装，真空冷冻干燥，置于2～8℃保存；
[0012]4)制备IL
‑
33校准品溶液：取高浓度的IL
‑
33抗原溶液用含2g/L的BSA和1g/L的
NaN3的50mmol/L的pH为7.8的Tris
‑
HCl反应缓冲液配制成不同浓度的校准品溶液，进行分装，2～8℃保存；
[0013]5)荧光增强液：体积浓度为3.6％的冰醋酸，0.5g/L的醋酸钠，0.05g/L的β
‑
萘甲酰三氟丙酮,0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1％的Triton X
‑
100的混合溶液；
[0014]6)反应缓冲液：含pH为7.8的50mmol/L Tris
‑
HCl含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/L DTPA、0.1ml/L Tween
‑
80和0.1％NaN3；
[0015]7)清洗液：含0.48g/L的Tris，12.49g/L的NaCl，1.11g/L的Tween
‑
20，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液。
[0016]本专利技术一种利用诊断试剂盒的检测方法，所述检测方法主要包括以下步骤：
[0017]1)分别取IL
‑
33的校准品溶液和待测样品，与包被抗IL
‑
33单抗的微孔板、反应缓冲液稀释的铕标记的抗IL
‑
33单抗溶液混合，进行孵育，然后用清洗液进行清洗，再加入增强液；
[0018]2)采用时间分辨荧光免疫分析仪分别测定加增强液后的溶液中铕的荧光值，获得所述IL
‑
33的校准品溶液和待测样品的荧光值；
[0019]3)根据IL
‑
33校准品溶液中各IL
‑
33的浓度和其各自对应的荧光值绘制标准曲线，然后将待测样品的荧光值代入对应的IL
‑
33标准曲线中，便可得到所述待测样品中IL
‑
33的含量。
[0020]本专利技术一种检测IL
‑
33的诊断试剂盒，包括包被反应板、镧系元素离子标记的抗IL
‑
33单抗；所述包被反应板为吸附有抗IL
‑
33单抗的微孔板；还包括校准品、反应缓冲液、洗涤液、荧光增强液。
[0021]优选的，所述镧系元素离子为Eu
3+
、Tb
3+
、Sm
3+
、Dy
3+
中的至少一种。
[0022]优选的，所述镧系元素离子为Eu
3+
。
[0023]优选的，所述荧光增强液含有β
‑
二酮类化合物或芳香胺类化合物。
[0024]有益效果：采用的是时间分辨免疫荧光分析法，应用镧系元素作为示踪剂，标记抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，检测IL
‑
33，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性优异、可测定范围宽、检测自动化程度高和无环境污染等优点；可以作为预后判断、评价抗病毒治疗效果的依据；利用时间分辨免疫荧光分析法同时检出波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异性荧光的干扰，极大的提高了灵敏度；本专利技术的包被反应板的为完全不透光的板架和相应配合的酶标板组成，使得阴性样本与Blank的荧光本底大大降低，信噪比显著提高，酶标板包被采用特殊辐照，使得包被效果显著提高，进而进一步地提高了试剂盒的灵敏度；市场前景广阔。
附图说明
[0025]图1为本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测IL
‑
33的诊断试剂盒的制备方法，其特征在于该制备方法包括下述步骤:1)制备预处理包被反应板：使用白色聚苯乙烯制备板架，预留与酶标板相互配合的通孔；酶标板与板架配合组装，获得预处理包被反应板，备用；2)包被板的获得：用反应缓冲液将抗IL
‑
33单抗稀释至1
‑
4μg/mL，以100μL/孔包被过夜，然后洗涤、封闭、干燥，将微孔板真空密封于铝箔袋内，冷藏备用；3)制备镧系元素离子标记的抗IL
‑
33单抗：取IL
‑
33抗体1mg，经PD
‑
10转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/L的pH为8.5的Na2CO3‑
NaHCO3缓冲液，获得浓缩至2g/L的IL
‑
33抗体溶液；取所述IL
‑
33抗体溶液500μL加入0.2mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，25℃下振荡反应20小时，将反应液转移到预先用pH为7.8的浓度为80mmol/L的Tris缓冲液平衡的Sephadex G
‑
50柱上进行层析，收集蛋白峰，稀释，进行分装，真空冷冻干燥，置于2～8℃保存；4)制备IL
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33校准品溶液：取高浓度的IL
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33抗原溶液用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH为7.8的Tris
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HCl反应缓冲液配制成不同浓度的校准品溶液，进行分装，2～8℃保存；5)荧光增强液：体积浓度为3.6％的冰醋酸，0.5g/L的醋酸钠，0.05g/L的β
‑
萘甲酰三氟丙酮,0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1％的Triton X
‑
100的混合溶液；6)反应缓冲液：含pH为7.8的50mmol/L Tris
‑
HCl含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/L DTPA、0.1ml/L Tween
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【专利技术属性】
技术研发人员：王毅刚，戴川景，李强，金皓，黄飚，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：