一种基于SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的方法及应用。该方法包括以下步骤：将含有系列浓度标志蛋白的样品于包被了捕获抗体Ab1的孔板中孵育，将所得产物与Ab2‑

【技术实现步骤摘要】
一种基于SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的方法及应用


[0001]本专利技术属于医学检测
，主要涉及一种基于SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的方法及应用。

技术介绍

[0002]ELISA是目前最为常用的免疫学检测技术之一，在全世界范围内被广泛应用于疾病诊断、食品安全和环境监控领域，它的操作比较简单，显色原理明确，容易控制生产工艺，稳定性良好。但是，对于一些检出限低的物质来说，ELISA的灵敏度是远远达不到要求的。
[0003]CRISPR/Cas是近些年兴起的一种用于核酸检测的酶，CRISPR/Cas蛋白与CRISPR RNA(crRNA)结合，crRNA能够识别特异性的核酸序列，Cas蛋白发挥核酸内切酶功能，对靶标核酸分子进行剪切。除了特异性核酸内切酶活性(靶向切割)外，CRISPR类型中的III、V和VI RNA引导的核酸酶(Cas12、Cas13和Cas14)还具有侧链靶向激活的非特异性单链核酸水解酶活性(侧链切割)，其中，Cas12a可在crRNA引导下特异性识别并剪切单链或双链DNA，一旦对靶DNA进行识别并剪切，Cas12a自身的非特异性DNA酶活性被激活，可高效剪切其他单链DNA。Cas12a的这种扩增特性，可用于构建高灵敏的检测方法。与本专利技术最相近似的实现方案是Nano
‑
CLISA，首先，抗原在96孔板中被包被抗体捕获，加入被抗原适配体和激活序列修饰金纳米(AuNPs)后，适配体与抗原结合，使得AuNPs被捕获；然后加入Cas12a
‑
crRNA以及荧光淬灭探针(FQ
‑
reporter)，Cas12a
‑
crRNA识别AuNPs表面的激活序列并剪切，Cas12a自身的非特异性DNA酶活性被激活，剪切FQ
‑
reporter，FQ
‑
reporter被剪断后荧光基团被释放，从而产生荧光信号实现检测。

技术实现思路

[0004]本专利技术的首要目的在于提供一种基于SERS和CRISPR/Cas联(CLISA)免疫吸附检测蛋白的方法，解决传统的酶联免疫吸附试验(ELISA)在蛋白标志物检测中的灵敏度不足的技术问题。
[0005]本专利技术的另一目的在于提供上述基于SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的方法的应用。
[0006]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0007]一种基于SERS和CRISPR/Cas联(CLISA)免疫吸附检测蛋白的方法，包括以下步骤：
[0008](1)将靶激活DNA连接到待测蛋白的检测抗体上；
[0009](2)将待测蛋白的捕获抗体进行固定，清洗；
[0010](3)在步骤(2)中固定的捕获抗体中加入待测样本，孵育；
[0011](4)在步骤(3)得到的体系中加入步骤(1)中连接了靶激活DNA的检测抗体，孵育后清洗；
[0012](5)在步骤(4)得到的体系中加入Cas12a蛋白、crRNA和拉曼探针，孵育后检测拉曼
信号，根据拉曼信号强度检测待测蛋白。
[0013]步骤(1)所述的靶激活DNA是一段核苷酸序列，能够与步骤(5)所述的crRNA互补结合，激活Cas12a的酶活性。
[0014]步骤(1)所述的待测蛋白包括至少有两个抗原决定簇的抗原蛋白，优选为前列腺特异抗原(PSA)、SARS
‑
CoV
‑
2N蛋白、γ干扰素(IFN
‑
γ)、癌胚抗原(CEA)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCCA)、甲胎蛋白(AFP)中的至少一种。
[0015]步骤(1)所述的连接为生物素
‑
链霉亲和素连接。
[0016]步骤(1)的具体步骤为：
[0017]将生物素修饰的靶激活DNA与链霉亲和素修饰的检测抗体共同孵育，得到连接了靶激活DNA的检测抗体。
[0018]步骤(2)所述的固定为固定在孔板中；优选固定后使用BSA进行封闭。
[0019]步骤(2)所述的捕获抗体的加入量为至少0.01mg；优选为至少0.1mg。
[0020]步骤(2)所述的清洗为使用PBST缓冲液清洗；优选为用PBST缓冲液清洗3次。
[0021]步骤(3)所述的孵育的条件为35～40℃，至少30min；优选为37℃，孵育1h。
[0022]步骤(4)所述的靶激活DNA的检测抗体的加入量为至少0.05μM，优选为至少0.5μM。
[0023]步骤(4)所述的孵育的条件为35～40℃，至少20min；优选为37℃，孵育30min。
[0024]步骤(4)所述的清洗为使用PBST缓冲液清洗；优选为用PBST缓冲液清洗3次。
[0025]步骤(5)所述的孵育的条件为35～40℃，至少10min；优选为37℃，孵育20min。
[0026]步骤(5)所述的拉曼探针由表面偶联4
‑
氨基苯硫酚(4ATP)的银纳米颗粒(AgNPs@4ATP)和表面修饰链霉亲和素的磁珠(SA
‑
MBs)构成，两部分之间用生物素修饰的单链DNA(ssDNA)连接。
[0027]步骤(5)所述的crRNA是一段核苷酸序列，能够与步骤(1)所述的靶激活DNA互补结合；所述crRNA可以作为Cas12a蛋白的引导RNA，帮助激活Cas12a蛋白的酶活性；所述crRNA特异性识别靶激活DNA序列后激活Cas12a的酶活性。
[0028]步骤(5)所述的检测拉曼信号为785nm激发激光下检测拉曼信号。
[0029]上述的检测拉曼信号为识别拉曼特征峰强度，依据标准曲线计算样品中的标志蛋白浓度；优选为识别4ATP的拉曼特征峰(1074cm
‑1)。
[0030]上述基于SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的方法在制备检测试剂盒中的应用。
[0031]上述的Cas12a蛋白，通过CRISPR RNA(crRNA)识别特异性的核酸序列，激活其非特异性核酸内切酶活性，对样品中的ssDNA进行随意剪切，操作更加稳定、简单。
[0032]步骤(1)所述的待测蛋白捕获抗体Ab1为针对待测蛋白上特定抗原表位的抗体，待测蛋白检测抗体Ab2为针对待测蛋白上特定抗原表位的抗体，但与Ab1针对的表位不同。当体系中同时含有待测蛋白、Ab1、Ab2时，三者会形成三明治状的双抗体夹心结构。
[0033]上述的Ab2通过生物素和链霉亲和素与靶激活DNA偶联，当样品中含有待测蛋白时，形成Ab1‑
待测蛋白
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Ab2的双抗体夹心结构，被吸附在孔板中，与Ab2相连的靶激活DNA会被crRNA识别，激活Cas12a蛋白的非特异性核酸内切酶活性，对体系中的核酸分子进行剪切。
[0034]现有技术的缺点在于：从原理上就可看出，Nano
‑
CLISA的缺点是操作复本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于SERS和CRISPR/Cas联免疫吸附检测蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将靶激活DNA连接到待测蛋白的检测抗体上；(2)将待测蛋白的捕获抗体进行固定，清洗；(3)在步骤(2)中固定的捕获抗体中加入待测样本，孵育；(4)在步骤(3)得到的体系中加入步骤(1)中连接了靶激活DNA的检测抗体，孵育后清洗；(5)在步骤(4)得到的体系中加入Cas12a蛋白、crRNA和拉曼探针，孵育后检测拉曼信号，根据拉曼信号强度检测待测蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的靶激活DNA是一段核苷酸序列，能够与步骤(5)所述的crRNA互补结合；步骤(5)所述的crRNA是一段核苷酸序列，能够与步骤(1)所述的靶激活DNA互补结合。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的crRNA特异性识别靶激活DNA序列后，作为Cas12a蛋白的引导RNA激活Cas12a的酶活性。4.根据权利要求1所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐勇，梁家杰，滕佩君，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：