一种用于评估下肢缺血患者病情严重度的生物标志物及其用途制造技术

本发明专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种用于诊断Fontaine分级严重(III、IV级)的下肢缺血患者与非严重的下肢缺血患者的生物标志物及其用途。本研究通过采用含有56种凝集素的凝集素芯片检测下肢缺血患者中Fontaine分级严重(III、IV级)患者与非严重患者血清IgG与凝集素特异性结合的聚糖差异。结果显示，与非严重患者相比，Jacalin(AIA)凝集素结合聚糖的含量在Fontaine分级严重患者中是升高的。凝集素免疫印迹验证结果表明Jacalin凝集素结合聚糖的含量在Fontaine分级严重患者中依然是升高的。可见，Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物可作为用于评估抗Fontaine分级严重与非严重下肢缺血患者的生物标志物。下肢缺血患者的生物标志物。

【技术实现步骤摘要】
一种用于评估下肢缺血患者病情严重度的生物标志物及其用途


[0001]本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种用于诊断Fontaine分级严重(III、IV级)的下肢缺血患者与非严重的下肢缺血患者的生物标志物及其用途。

技术介绍

[0002]下肢外周动脉疾病(Lower extremity peripheral artery disease， LEAD)又称下肢缺血，是一种由于动脉粥样硬化导致的下肢动脉管腔狭窄或阻塞，从而出现肢体血液供应不足症状和体征的疾病，可表现为间歇性跛行、肢体疼痛，严重者可发展为肢端溃疡、坏疽，最终致残、截肢。下肢缺血为外周动脉疾病(peripheral arterial disease，PAD) 的主要部分，中国人群60岁以上患病率约为15.3％。然而，PAD的知晓率、诊断率及治疗率很低。Fontaine分级是评价下肢缺血患者病情严重程度的常用方法：I期:轻微症状期；II期:间歇性跛行期；III期: 静息痛期；IV期:溃疡坏疽期；其中III、IV期患者定义为严重下肢缺血。然而，Fontaine分级依靠的临床症状与体征在患者中存在异质性，无法准确反映患者血管狭窄程度、外科治疗难度及预后。早期识别严重下肢缺血患者将有助于疾病的预防与提前干预。
[0003]在包括下肢缺血在内的动脉粥样硬化疾病中，炎症状态与血管重塑是重要的特点与发病机制。近年来，抗体与自身免疫反应在该过程中的作用受到日益关注。IgG是人体内含量最丰富的抗体。它参与多种体液免疫过程：抗原中和、补体激活和补体依赖性细胞毒(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)和超敏反应。多糖是由多达15 个单糖残基组成的复杂低聚糖，约占IgG重量的15％，是IgG不可分割的部分，它组成的变化会影响IgG的结构稳定性、构象和半衰期，以及它的效应器功能。事实上，如果多糖完全去除会导致IgG促炎活性和抗炎活性的丧失。已有越来越多的证据表明，IgG糖基化在自身免疫与炎症性疾病中发挥着重要的作用。拟通过高通量的糖基化分析技术——凝集素微阵列技术来探究Fontaine分级严重与非严重下肢缺血患者血清IgG聚糖差异，以期探讨糖基化两者在下肢缺血中的临床应用价值。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供一种用于用于诊断Fontaine分级严重(III、IV级)的下肢缺血患者与非严重的下肢缺血患者的生物标志物及其用途。
[0005]首先，本专利技术提供一种用于诊断Fontaine分级严重(III、IV级) 的下肢缺血患者与非严重的下肢缺血患者的生物标志物，其为Jacalin 凝集素与IgG结合所形成的复合物。
[0006]其中，所述的IgG含有半乳糖
‑
乙酰半乳糖胺。
[0007]其次，本专利技术还提供所述生物标志物在用于制备诊断Fontaine分级的下肢缺血患者与非严重的下肢缺血患者的试剂中的用途。
[0008]具体地，所述诊断包括：测定待测的生物样品中Jacalin凝集素与IgG结合所形成
的复合物；
[0009]与作为对照的Fontaine分级严重的下肢缺血患者的Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平进行比较，相对于所述对照数据，所述样品中Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平无显著性差异；并且与作为对照的Fontaine分级非严重的下肢缺血患者的 Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平进行比较，相对于所述对照数据，所述样品中Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平可检测地升高表明生物样品来自下肢缺血Fontaine分级严重的患者的可能性；或者
[0010]与作为对照的Fontaine分级严重的下肢缺血患者的Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平进行比较，相对于所述对照数据，所述样品中Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平显著性降低；并且与作为对照的Fontaine分级非严重的下肢缺血患者的 Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平进行比较，相对于所述对照数据，所述样品中Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平无显著差异，表明待测生物样品来自下肢缺血Fontaine分级非严重的患者的可能性。
[0011]其中，所述生物样品为血清样品。
[0012]优选的，Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平均通过以下步骤来测量，包括：
[0013]a.使来自患者的生物样品与Jacalin凝集素接触；
[0014]b.在生物样品中存在的IgG与Jacalin凝集素形成凝集素
‑
聚糖复合物；
[0015]c.洗涤来除去任何未结合的IgG；
[0016]d.添加被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体；
[0017]e.洗涤来除去任何未结合的被标记的所述检测抗体；和
[0018]f.将所述检测抗体的标记物转化为可检测信号。
[0019]其中，所述的Jacalin凝集素沉积或固定在固相表面载体上，优选地，所述的固相表面载体是乳胶珠子、多孔平板或膜条、纳米管道、带二维码的薄片等的形式，优选地，所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的标记物来标记。
[0020]本研究通过采用含有56种凝集素的凝集素芯片检测下肢缺血患者中Fontaine分级严重(III、IV级)患者与非严重患者血清IgG与凝集素特异性结合的聚糖差异。结果显示，与非严重患者相比，Jacalin 凝集素结合聚糖的含量在Fontaine分级严重患者中是显著升高的。由于Jacalin凝集素是特异性结合半乳糖
‑
乙酰半乳糖胺(Galβ3GalNAc)，这表明Galβ3GalNAc水平在Fontaine分级严重的下肢缺血患者中的表达是增加的。为了证实这一结果的可靠性，本研究还采用凝集素免疫印迹验证结果。结果表明Jacalin凝集素结合聚糖的含量在Fontaine 分级严重患者中依然是增加的，与凝集素微芯片的结果相符合。
附图说明
[0021]图1 A为整张凝集素芯片；1B
‑
1C为芯片微阵列56种凝集素的位置。
[0022]图2所示为凝集素芯片检测下肢缺血患者中Fontaine分级严重和非严重患者血清IgG与凝集素Jacalin特异性结合信噪比(*p<0.05)。
[0023]图3所示为凝集素Jacalin免疫印迹图示意。
[0024]图4所示为凝集素Jacalin免疫印迹荧光数值结果，Fontaine分级严重和非严重患者相比显著升高(p<0.05)。
[0025]图5所示为凝集素Jacalin凝集素芯片结果在区分Fontaine严重与非严重的下肢缺血患者中的ROC曲线分析。
具体实施方式
[0026]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于诊断Fontaine分级严重(III、IV级)的下肢缺血患者与非严重的下肢缺血患者的生物标志物，其为木菠萝凝集素Jacalin素与IgG结合所形成的复合物。2.如权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述IgG含有半乳糖
‑
乙酰半乳糖胺。3.权利要求1或2所述的生物标志物在用于制备诊断Fontaine分级严重的下肢缺血患者与非严重的下肢缺血患者的试剂中的用途。4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述诊断包括：测定待测的生物样品中Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物；与作为对照的Fontaine分级严重的下肢缺血患者的Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平进行比较，相对于所述对照数据，所述样品中Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平无显著性差异；并且与作为对照的Fontaine分级非严重的下肢缺血患者的Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平进行比较，相对于所述对照数据，所述样品中Jacalin凝集素与IgG结合所形成的复合物的水平可检测地升高表...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡朝军，李斯亭，郑月宏，曾小峰，李梦涛，田新平，王迁，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：