本发明专利技术公开了一种VIII因子活性测定试剂盒及其制备方法，试剂盒包括乏VIII因子血浆、标准血浆和样本稀释液；乏VIII因子血浆包括：氨基酸、防腐剂、冻干保护剂，其余为添加抗凝剂且利用单克隆抗体制成的乏VIII因子血浆原料；标准血浆包括：氨基酸、防腐剂、冻干保护剂，其余为添加抗凝剂的标准血浆原料；样本稀释液包括：稳定剂、防腐剂、缓冲液，其余为水；制备方法：制备亲和免疫胶，制备乏VIII因子血浆，制备标准血浆，制备样本稀释液。本发明专利技术的乏VIII因子血浆试剂盒生物安全性高，线性范围较广，线性范围内测试相关性良好，精密度较高，且制备方法简便易操作。方法简便易操作。方法简便易操作。
【技术实现步骤摘要】
VIII因子活性测定试剂盒及其制备方法
[0001]本专利技术涉及医学体外诊断
，尤其涉及一种VIII因子活性测定试剂盒及其制备方法。
技术介绍
[0002]分析FVIII的凝血活性在临床诊断甲型血友病和生产治疗用的因子VIII浓制剂中是非常重要的。
[0003]测定FVIII：C活性方法目前主要有两种，一期法和二期法。二期法操作繁琐，不易推广。一期法操作相对简单，颇受欢迎。但这种方法需要一种因子 VIII缺乏血浆作为基质。这种试剂需要从严重的血友病病人中得到，但这种来源非常有限，且有传染肝炎和艾滋病的风险，所以需提供人工制备的因子VIII 缺乏血浆。人工制备的因子VIII缺乏血浆在使用上较为安全，又可大量生产，以满足临床和研究需求。
技术实现思路
[0004]本专利技术要解决的技术问题在于，针对现有技术中，人工制备的因子VIII缺乏血浆的来源非常有限且生物风险高，提供一种VIII因子活性测定试剂盒及其制备方法。
[0005]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种VIII因子活性测定试剂盒，包括乏VIII因子血浆、标准血浆和样本稀释液；乏VIII因子血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：20～50g氨基酸、0.5～1.5g防腐剂、15～40g冻干保护剂，其余为添加抗凝剂且利用单克隆抗体制成的乏VIII因子血浆原料；标准血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：20～50g氨基酸、0.5～1.5g防腐剂、15～40g 冻干保护剂，其余为添加抗凝剂的标准血浆原料；抗凝剂以其总体积为1L计，包括30～40g枸橼酸钠和水，且抗凝剂与正常人血浆的体积比为1:(8～10)；样本稀释液以其总体积为1L计，包括以下组分：11～25g稳定剂、0.5～1.5g防腐剂、含量为1mol且pH值为6.0～8.0的缓冲液，其余为水。
[0006]优选地，防腐剂为DN、Proclin
‑
300、硫柳汞、庆大霉素或卡松。
[0007]优选地，冻干保护剂包括10～30g甘露醇和5～10g海藻糖。
[0008]优选地，氨基酸为甘氨酸、丙氨酸或精氨酸。
[0009]优选地，缓冲液为Tris缓冲液、HEPES缓冲液或PBS缓冲液。
[0010]优选地，稳定剂包括3～5g巴比妥钠、3～5g无机盐和5～15g白蛋白。
[0011]优选地，无机盐为氯化钠、氯化钙或硫酸铵。
[0012]优选地，白蛋白为牛血清白蛋白、马血清白蛋白或人血清白蛋白。
[0013]一种上述VIII因子活性测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
[0014]S1、制备亲和免疫胶：将抗体A、抗体B和抗体C分别与溴化氰活化的琼脂糖凝胶偶联，得到亲和免疫胶，将其装入亲和层析柱，将亲和层析柱串联，用平衡液流洗；抗体A为抗vWF单克隆抗体，抗体B为抗FVIII重链单克隆抗体，抗体C为抗FVIII轻链单克隆抗体；
[0015]S2、乏VIII因子血浆的制备：将抗凝剂与正常人血浆按体积比为1:(8～10) 混合
并离心，取上清血浆装入S1步骤所得的亲和层析柱，收集流出液；以流出液的总体积为1L计，在流出液中添加20～50g氨基酸、0.5～1.5g防腐剂和15～40g 冻干保护剂，分装并进行冻干，得到乏VIII因子血浆冻干粉；
[0016]S3、标准血浆的制备：将抗凝剂与正常人血浆按体积比为1:(8～10)混合并离心，取上清血浆；以标准血浆的总体积为1L计，在上清血浆中添加20～50g 氨基酸、0.5～1.5g防腐剂、15～40g冻干保护剂，分装并进行冻干，得到标准血浆冻干粉；
[0017]S4、样本稀释液的制备：以稀释液总体积为1L计，将11～25g稳定剂、 0.5～1.5g防腐剂、含量为1mol且pH值为6.0～8.0的缓冲液和水混合，得到样本稀释液。
[0018]优选地，步骤S1中抗体A和溴化氰活化的琼脂糖凝胶的体积比为 (0.9～1.1):1，抗体B和溴化氰活化的琼脂糖凝胶的体积比为(0.8～1.2):1，抗体C和溴化氰活化的琼脂糖凝胶的体积比为(0.8～1.2):1。
[0019]优选地，平衡液以其总体积为1L计，由8～10g氯化钠和含量为1mol且pH值为6.0～8.0的Tris缓冲液组成；平衡液与亲和免疫胶的体积比为(5～10):1。
[0020]优选地，在步骤S2和S3中，离心的温度为2～6℃，转速为2000～4000rpm，时间为10～20min。
[0021]优选地，步骤S2中正常人血浆冷上清从亲和层析柱流出的速度为 20～40mL/h。
[0022]优选地，免疫亲和胶和正常人血浆冷上清的体积比为1:(4～5)。
[0023]本专利技术的有益效果：
[0024]本专利技术通过单克隆抗体偶联亲和层析技术，将正常人血浆纯化制得乏VIII 因子血浆，其生物风险低且可工业化生产；本专利技术通过冻干工艺制得冻干血浆。本专利技术的VIII因子活性测定试剂盒产量可保障，用于甲型血友病的诊断，且线性范围较广，线性范围内测试相关性良好，精密度较高。
[0025]本专利技术提供一种VIII因子活性测定试剂盒的制备方法，该制备方法的操作过程简单，可用于工业化生产，保证质量，实用性强，易于推广。
附图说明
[0026]图1是本专利技术实施例1测试校准品的理论值和测试值的线性；
[0027]图2是本专利技术实施例2测试校准品的理论值和测试值的线性。
具体实施方式
[0028]为了对本专利技术的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，下面将结合实施例对本专利技术做进一步详述，本实施例仅用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术保护范围的限定。
[0029]一种VIII因子活性测定试剂盒，包括乏VIII因子血浆、标准血浆和样本稀释液；乏VIII因子血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：20～50g氨基酸、 0.5～1.5g防腐剂、15～40g冻干保护剂，其余为添加抗凝剂且利用单克隆抗体制成的乏VIII因子血浆原料；标准血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：20～50g 氨基酸、0.5～1.5g防腐剂、15～40g冻干保护剂，其余为添加抗凝剂的标准血浆原料；抗凝剂以其总体积为1L计，包括30～40g枸橼酸钠和水，且抗凝剂与正常人血浆的体积比为1:(8～10)；样本稀释液以其总体积为1L计，包括以下组分：11～25g稳定剂、0.5～1.5g防腐剂、含量为1mol且pH值为6.0～8.0的缓冲液，
其余为水。
[0030]其中，抗凝剂为枸橼酸钠溶液，用于延缓血液凝固时间。
[0031]防腐剂为DN、Proclin
‑
300、硫柳汞、庆大霉素或卡松。
[0032]冻干保护剂包括10～30g甘露醇和5～10g海藻糖。
[0033]氨基酸为甘氨酸、丙氨酸或精氨酸，可以提高血浆稳定性。
[0034]缓冲液为Tris缓冲液、HEPES缓冲液或PBS缓冲液。
[0035]稳定剂包本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种VIII因子活性测定试剂盒，其特征在于，包括乏VIII因子血浆、标准血浆和样本稀释液；所述乏VIII因子血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：20～50g氨基酸、0.5～1.5g防腐剂、15～40g冻干保护剂，其余为添加抗凝剂且利用单克隆抗体制成的乏VIII因子血浆原料；所述标准血浆以其总体积为1L计，包括以下组分：20～50g氨基酸、0.5～1.5g防腐剂、15～40g冻干保护剂，其余为添加抗凝剂的标准血浆原料；所述抗凝剂以其总体积为1L计，包括30～40g枸橼酸钠和水，且抗凝剂与正常人血浆的体积比为1:(8～10)；所述样本稀释液以其总体积为1L计，包括以下组分：11～25g稳定剂、0.5～1.5g防腐剂、含量为1mol且pH值为6.0～8.0的缓冲液，其余为水。2.根据权利要求1所述的VIII因子活性测定试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为DN、Proclin
‑
300、硫柳汞、庆大霉素或卡松。3.根据权利要求1所述的VIII因子活性测定试剂盒，其特征在于，所述冻干保护剂包括10～30g甘露醇和5～10g海藻糖。4.根据权利要求1所述的VIII因子活性测定试剂盒，其特征在于，所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸或精氨酸。5.根据权利要求1所述的VIII因子活性测定试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为Tris缓冲液、HEPES缓冲液或PBS缓冲液。6.根据权利要求1所述的VIII因子活性测定试剂盒，其特征在于，所述稳定剂包括3～5g巴比妥钠、3～5g无机盐和5～15g白蛋白。7.根据权利要求6所述的VIII因子活性测定试剂盒，其特征在于，所述无机盐为氯化钠、氯化钙或硫酸铵。8.根据权利要求6所述的VIII因子活性测定试剂盒，其特征在于，所述白蛋白为牛血清白蛋白、马血清白蛋白或人血清白蛋白。9.一种VIII因子活性测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、制备亲和免疫胶：将抗体A、抗体B和抗体C分别与溴化氰活化的琼脂糖凝胶偶联，得到亲和免疫胶，将其装入亲和层析柱，将亲和层析柱串联，用平衡液流洗；所述抗体A为抗vWF单克隆抗体，抗体...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑琳，
申请(专利权)人：深圳市帝迈生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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