一种检测大麻二酚的时间分辨荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用技术

一种检测大麻二酚的时间分辨荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用，该试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板。结合物释放垫上喷涂有时间分辨荧光微球标记的大麻二酚单克隆抗体，反应膜上固定有检测线与质控线，检测线包被有大麻二酚半抗原

【技术实现步骤摘要】
一种检测大麻二酚的时间分辨荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于试纸条制备与应用
，具体是一种检测大麻二酚的时间分辨荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]大麻二酚即CBD，是一种从大麻中提取的植物大麻素，缺乏精神活性，具有镇痛、抗炎、抗肿瘤和化学预防活性。大麻二酚具有阻断某些多酚对人体神经系统的不利影响，并且具有阻断乳腺癌转移、治疗癫痫、抗类风湿关节炎、抗失眠等一系列生理活性功能，对治疗多发性硬化症也有良好的效果。
[0003]工业大麻是指四氢大麻酚(THC)含量低于0.3%的大麻，是大麻科(Cannabaceae)大麻属(Cannabis)一年生草本植物。工业大麻花叶提取物大麻二酚（CBD）具有广阔的市场前景， 工业大麻中大麻二酚含量的测定则有助于对工业大麻种植过程中CBD含量的监控以及工业大麻品种的优化。
[0004]目前常用的大麻二酚检测方法主要是仪器方法，如高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法，采用这些分析方法不仅需要昂贵的仪器和专业的技术人员，样品前处理过程复杂、周期长、成本高，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。基于抗原抗体特异性识别的免疫分析方法可以定性定量检测样品中的大麻二酚含量。
[0005]时间分辨荧光免疫层析技术采用聚苯乙烯纳米微球对稀土荧光离子进行包裹，通过荧光预增强技术，提升单个荧光离子的荧光强度。通过对包裹技术的优化和改良，包裹完荧光离子后，在微球表面再进行葡聚糖修饰，大大提升了微球的稳定性和对可逆环境的抗干扰性。在此基础上可开发出的荧光定量免疫层析技术灵敏度高于胶体金、有色乳胶和普通荧光免疫层析方法1
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3个数量级，稳定性和精密度更好，线性范围更宽。因此，基于时间分辨荧光的免疫层析技术定量试纸条具有高灵敏度、高通量、简单快速的优点。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的正是基于所述现有技术状况而提供一种检测大麻二酚的时间分辨荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法，并提供一种快速、简单、高效的适用于大批量样品的定性检测方法。
[0007]本专利技术的试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；其中：结合物释放垫上喷涂有时间分辨荧光微球标记的大麻二酚单克隆抗体，反应膜上固定有检测线与质控线，检测线包被有大麻二酚半抗原
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载体蛋白偶联物，质控线包被有山羊抗小鼠二抗，大麻二酚单克隆抗体是以大麻二酚半抗原与载体蛋白偶联物作为免疫原获得，大麻二酚半抗原由以下方法制备而成：由3,5
‑
二甲氧基苯甲醛与三乙基
‑4‑
磷化物反应生成（2E，4E）
‑5‑
（3,5
‑
二甲氧基苯基）
‑
2,4
‑
戊二烯酸乙酯，随后经PdC/H2还原，HBr/HoAc脱甲基和皂化反应得到5
‑
（3,5
‑
二羟苯基）戊酸，最后再与(1S,4R)
‑1‑
甲基
‑4‑
(1
‑
甲基乙烯基)
‑2‑
环己
烯
‑1‑
醇反应得到，所述大麻二酚半抗原的结构式如下：具体反应过程参见图4。
[0008]所述载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或甲状腺蛋白。
[0009]所述山羊抗小鼠抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。
[0010]所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，所述结合物释放垫1/3~1/2被覆盖于样品吸收垫下。
[0011]所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃纤维或聚酯纤维；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
[0012]所诉时间分辨荧光微球是直径为100 nm
‑
500 nm的稀土离子作为包埋物的荧光微球，其表面修饰有功能基团，用于蛋白、抗体和核酸的共价偶联。
[0013]所述时间分辨荧光微球的激发波长为300
‑
400 nm，发射波长为500
‑
700 nm。
[0014]本专利技术的一种制备上述检测大麻二酚的试纸条的方法，包括以下步骤：1）制备喷涂时间分辨荧光微球标记的大麻二酚单克隆抗体释放垫；2）制备具有包被有大麻二酚半抗原
‑
载体蛋白偶联物的检测线和包被有山羊抗小鼠二抗的质控线的反应膜。
[0015]3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
[0016]具体地说，步骤包括：1）半抗原制备：3,5
‑
二甲氧基苯甲醛与三乙基
‑4‑
磷化物反应生成（2E，4E）
‑5‑
（3,5
‑
二甲氧基苯基）
‑
2,4
‑
戊二烯酸乙酯，随后经PdC/H2还原，HBr/HoAc脱甲基和皂化反应得到5
‑
（3,5
‑
二羟苯基）戊酸，最后再与(1S,4R)
‑1‑
甲基
‑4‑
(1
‑
甲基乙烯基)
‑2‑
环己烯
‑1‑
醇反应得到大麻二酚半抗原；2）将大麻二酚半抗原与载体蛋白偶联，得到大麻二酚半抗原
‑
载体蛋白偶联物；3）用大麻二酚半抗原
‑
载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到大麻二酚杂交瘤细胞株；4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到山羊抗小鼠二抗；5）将步骤3）制备的大麻二酚单克隆抗体与时间分辨荧光微球共价偶联；6）将时间分辨荧光微球标记的大麻二酚单克隆抗体喷涂在结合物释放垫上，37℃烘12h后取出，置于干燥环境中保存备用；8）将大麻二酚半抗原
‑
载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线，将山羊抗小鼠二抗包被在反应膜上构成质控线；9）将样品吸收垫用含0.2%Tween20、0.5%PVP K30、0.5%牛血清白蛋白、pH为7.4、
0.02mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干24h，置于干燥环境中保存备用；10）在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成4mm宽的小条，放入干燥剂，置于铝箔袋中密封，4~30℃条件下可保存12个月。
[0017]本专利技术的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测工业大麻中大麻二酚的方法，它包括步骤：（1）将待测样本进行前处理，得到待测样本溶液；（2）用试纸条进行检测；（3）将检测卡插入免疫荧光分析仪，分析仪可通过内置的标准曲线计算出样品中大麻二酚的浓度，分析检测结果。
[0018]本专利技术的大麻二酚快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测大麻二酚的时间分辨荧光微球免疫层析试纸条，试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；其特征在于：结合物释放垫上喷涂有时间分辨荧光微球标记的大麻二酚单克隆抗体，反应膜上固定有检测线与质控线，检测线包被有大麻二酚半抗原
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载体蛋白偶联物，质控线包被有山羊抗小鼠二抗，大麻二酚单克隆抗体是以大麻二酚半抗原与载体蛋白偶联物作为免疫原获得，大麻二酚半抗原由以下方法制备而成：由3,5
‑
二甲氧基苯甲醛与三乙基
‑4‑
磷化物反应生成（2E，4E）
‑5‑
（3,5
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二甲氧基苯基）
‑
2,4
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戊二烯酸乙酯，随后经PdC/H2还原，HBr/HoAc脱甲基和皂化反应得到5
‑
（3,5
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二羟苯基）戊酸，最后再与(1S,4R)
‑1‑
甲基
‑4‑
(1
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甲基乙烯基)
‑2‑
环己烯
‑1‑
醇反应得到，所述大麻二酚半抗原的结构式如下：。2. 根据权利要求1 所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。3.根据权利要求1 所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所诉时间分辨荧光微球是直径为100
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500 nm的稀土离子作为包埋物的荧光微球，其表面修饰有功能基团，用于蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕小翠，贾嘉，袁利杰，孟二娟，赵琳，夏静雪，石小青，陈丽丽，崔浩哲，纪元，
申请(专利权)人：郑州左安检测科技有限公司，
类型：发明
国别省市：