一种大麻二酚半抗原与完全抗原的制备方法及应用技术

一种大麻二酚半抗原与完全抗原的制备方法及应用，大麻二酚半抗原是由3,5

【技术实现步骤摘要】
一种大麻二酚半抗原与完全抗原的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种大麻二酚半抗原与完全抗原的制备方法及应用。属于生物


技术介绍

[0002]大麻二酚即CBD，是一种从大麻中提取的植物大麻素，缺乏精神活性，具有镇痛、抗炎、抗肿瘤和化学预防活性。大麻二酚具有阻断某些多酚对人体神经系统的不利影响，并且具有阻断乳腺癌转移、治疗癫痫、抗类风湿关节炎、抗失眠等一系列生理活性功能，对治疗多发性硬化症具有良好的效果。
[0003]工业大麻是指四氢大麻酚(THC)含量低于0.3%的大麻，是大麻科(Cannabaceae)大麻属(Cannabis)一年生草本植物。工业大麻花叶提取物大麻二酚（CBD）具有广阔的市场前景， 工业大麻中大麻二酚含量的测定则有助于对工业大麻种植过程中CBD含量的监控以及工业大麻品种的优化。
[0004]目前常用的大麻二酚检测方法主要是仪器方法，如高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法，采用这些分析方法不仅需要昂贵的仪器和专业的技术人员，样品前处理过程复杂、周期长、成本高，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。基于抗原抗体特异性识别的免疫分析方法可以定性定量检测样品中的大麻二酚含量。
[0005]免疫分析是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，然而得到高亲和力和高特异性的单克隆抗体是免疫学检测的前提，人工抗原的合成则是其中重要的一步。
[0006]与现有的检测方法相比，基于抗原
–
抗体特异性分子识别的免疫检测方法，在现场检测方面具有更大优势，表现出快速、灵敏、简便等特点，并且成本低廉，对操作人员技能要求较低。然而，免疫分析方法研发的关键在于设计出合适的大麻二酚半抗原，制备出灵敏度高、特异性强的抗体，但是现有技术中未见有关于大麻二酚半抗原与完全抗原的相关报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中大麻二酚检测方法的缺陷和不足，提供一种大麻二酚半抗原与完全抗原的制备方法及应用。本专利技术制备的大麻二酚半抗原不仅最大程度上保留了大麻二酚的特征结构，而且与载体蛋白偶联存在合适结构的连接臂，尽可能让大麻二酚特征结构充分暴露于机体，增强免疫效果，提高抗体的特异性，降低与其他大麻二酚类似物的交叉反应；本专利技术制备的大麻二酚半抗原在原有结构上引入羧基，有利于制备大麻二酚人工抗原；本专利技术提供的大麻二酚人工抗原具有强的免疫原性，有利于刺激机体完成免疫应答，从而获得高质量的单克隆抗体，为大麻二酚免疫分析方法的建立提供核心试剂。
[0008]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种大麻二酚半抗原的制备方法，是由3,5
‑
二甲氧基苯甲醛与三乙基
‑4‑
磷化物反应生成（2E，4E）
‑5‑
（3,5
‑
二甲氧基苯基）
‑
2,4
‑
戊二烯酸乙酯，随后经PdC/H2还原，HBr/
HoAc脱甲基和皂化反应得到5
‑
（3,5
‑
二羟苯基）戊酸，最后再与(1S,4R)
‑1‑
甲基
‑4‑
(1
‑
甲基乙烯基)
‑2‑
环己烯
‑1‑
醇反应得到，其分子结构式为：；具体反应路线见图1。
[0009]该制备方法的具体步骤如下：1）取氢化钠0.87g（22mmol），加20ml干燥无水的四氢呋喃搅拌形成悬浮液，冰浴下逐滴加入含有5g三乙基
‑4‑
磷化物（20mmol）的无水的四氢呋喃50ml，搅拌反应30min。随后逐滴加入含有2.77g 3,5
‑
二甲氧基苯甲醛的无水的四氢呋喃50ml，移除冰浴，并在室温下搅拌反应1h，然后加热到60℃反应1h。TLC确定反应结束后，将反应液冷却至室温，并用120ml水淬灭反应，用120ml乙酸乙酯萃取水相3次，合并有机相，饱和食盐水反萃有机相，无水硫酸钠干燥过夜，旋蒸得到4.0g中间体1。
[0010]2）将3.6g中间体1和10% Pd
‑
C（0.74g）加入至75ml甲醇中，在室温下加氢气搅拌反应2h，过滤Pd
‑
C，将滤液浓缩，得到3.5g淡黄色油状液体（中间体2）。
[0011]3）在中间体2中加入50ml 40%氢溴酸，50ml冰醋酸，60℃回流反应4h。TLC确定反应结束后，将反应混合物冷却至室温并添加冰水150ml。反应混合物用150ml乙酸乙酯萃取3次，饱和食盐水反萃有机相，无水硫酸钠干燥过夜，浓缩有机相得到黑色油状粗产物。粗产物通过柱层析（乙酸乙酯/己烷1：2）纯化，得到2.50g中间体3。
[0012]4）取1g中间体3（4.75mmol），0.18g p
‑
TsOH（0.95mmol）加入50ml THF：DCM（1：4）混合液中，搅拌混匀，逐滴加入1.08g (1S,4R)
‑1‑
甲基
‑4‑
(1
‑
甲基乙烯基)
‑2‑
环己烯
‑1‑
醇，室温下搅拌反应30min，TLC确定反应的进程，最后加入50ml乙酸乙酯来终止反应，并用NaHCO3溶液调节溶液的pH值至3
‑
4，分离有机相，用饱和食盐水洗涤两次，干燥浓缩得到油状粗产物2.3g，经柱层析简单纯化后再制备HPLC进一步纯化，得到大麻二酚半抗原220mg。
[0013]所述大麻二酚半抗原可用于制作动物免疫的抗原体系原料。
[0014]一种大麻二酚完全抗原的制备方法，是由按上述制备方法得到的大麻二酚半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、甲状腺蛋白。
[0015]该制备方法的具体步骤如下：免疫抗原的制备：取20mg半抗原，EDC 23mg，NHS 14mg加入1ml二氧六环溶解完全得到A液，室温搅拌反应4h。取50mg 牛血清白蛋白用5ml 10mM PBS搅拌溶解完全得到B液。将A液逐滴加入至B液中，4℃搅拌反应过夜。反应结束后将蛋白溶液用10mM PBS透析3天，每6h换液一次，得到大麻二酚
‑
牛血清白蛋白偶联物即得免疫抗原CBD
‑
BSA。
[0016]包被抗原的制备：取10mg半抗原，EDC 12mg，NHS 7mg加入1ml无水DMF溶解完全得到A液，室温搅拌反应4h。取20mg 卵清蛋白用5ml 10mM PBS搅拌溶解完全得到B液。将A液逐滴加入至B液中，4℃搅拌反应过夜。反应结束后将蛋白溶液用10mM PBS透析3天，每6h换液一次，得到大麻二酚
‑
卵清蛋白偶联物即得包被抗原CBD
‑
OVA。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：（1）本专利技术提供了一种大麻二酚的半抗原，应用半抗原偶联载体蛋白制备得到的人工抗原作为免疫原，进而本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大麻二酚半抗原的制备方法，其特征在于：是由3,5
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二甲氧基苯甲醛与三乙基
‑4‑
磷化物反应生成（2E，4E）
‑5‑
（3,5
‑
二甲氧基苯基）
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2,4
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戊二烯酸乙酯，随后经PdC/H2还原，HBr/HoAc脱甲基和皂化反应得到5
‑
（3,5
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二羟苯基）戊酸，最后再与(1S,4R)
‑1‑
甲基
‑4‑
(1
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甲基乙烯基)
‑2‑
环己烯
‑1‑
醇反应得到，其分子结构式为：；具体反应过程如下：。2.根据权利要求1所述的大麻二酚半抗原的制备方法，其特征在于：该制备方法的具体步骤如下：S1.制备大麻二酚中间体1取氢化钠0.87g，加20ml干燥无水的四氢呋喃搅拌形成悬浮液，冰浴下逐滴加入含有5g三乙基
‑4‑
磷化物的无水的四氢呋喃50ml，搅拌反应30min；随后逐滴加入含有2.77g 3,5
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二甲氧基苯甲醛的无水的四氢呋喃50ml，移除冰浴，并在室温下搅拌反应1h，然后加热到60℃反应1h；TLC确定反应结束后，将反应液冷却至室温，并用120ml水淬灭反应，用120ml乙酸乙酯萃取水相3次，合并有机相，饱和食盐水反萃有机相，无水硫酸钠干燥过夜，旋蒸得到4.0g中间体1；S2.制备大麻二酚中间体2将3.6g中间体1和0.74g 10% Pd
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C加入至75ml甲醇中，在室温下加氢气搅拌反应2h，过滤Pd
‑
C，将滤液浓缩，得到3.5g淡黄色油状液体即中间体2；
S3.制备大麻二酚中间体3在中间体2中加入50ml 40%氢溴酸，50ml冰醋酸，60℃回流反应4h；TLC确定反应结束后，将反应混合物冷却至室温并添加冰水150ml；反应混合物用150ml乙酸乙酯萃取3次，饱和食盐水反萃有机相，无水硫酸钠干燥过夜，浓缩有机相得到黑色油状粗产物；粗产物通过柱层析纯化，得到2.50g中间体3；S4.制备大麻二酚半抗原取1g中间体3，0.18g p
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TsOH加入至50ml THF：D...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾嘉，纪元，孟二娟，赵琳，石小青，陈丽丽，崔浩哲，夏静雪，吕小翠，袁利杰，
申请(专利权)人：郑州左安检测科技有限公司，
类型：发明
国别省市：