一种CAR-T细胞的培养体系及应用和培养方法技术

本发明专利技术属于细胞免疫技术领域，具体涉及一种CAR

【技术实现步骤摘要】
一种CAR
‑
T细胞的培养体系及应用和培养方法


[0001]本专利技术属于细胞免疫
，具体涉及一种CAR
‑
T细胞的培养体系及应用和培养方法。

技术介绍

[0002]CAR
‑
T细胞疗法是一种过继细胞疗法，在治疗恶性血液病方面取得了显著的成功。FDA已批准多个产品用于治疗b细胞急性淋巴细胞白血病(B
‑
ALL)、大b细胞淋巴瘤(DLBCL)、复发/难治性b细胞淋巴瘤(r/r LBCL)或复发/难治性多发性骨髓(r/rMM)等恶性血液肿瘤，但仍有约40％～50％的患者出现耐药。导致CAR
‑
T细胞治疗失败的原因是复杂而多样的。例如，CAR
‑
T细胞在体内的持久性与患者的预后密切相关；低分化的CAR
‑
T细胞的临床反馈优于高分化的CAR
‑
T细胞，高分化的CAR
‑
T细胞以丢失自我更新能力为代价获取杀伤能力；同时，CAR
‑
T细胞耗竭也极大地影响了其治疗效果，CAR
‑
T细胞耗竭表现为自我更新能力降低；PD
‑
1、CTLA
‑
4和TIGIT等抑制性受体表达上调；颗粒霉素B、穿孔素、IFN
‑
γ、TNF
‑
α18
‑
21等分子表达下调等。因此缓解CAR
‑
T细胞的耗竭状态成为临床应用亟待解决的问题之一。
专利
技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种CAR
‑
T细胞的培养体系及应用和培养方法，所述培养体系显著改善CAR
‑
T细胞耗竭水平，利用所述培养体系扩增的CAR
‑
T细胞(spd CAR
‑
T)处于低分化状态，其抗原依赖的增殖能力和IL
‑
2、IFN
‑
γ表达增加，对淋巴瘤细胞的裂解能力得到提升。
[0004]本专利技术提供了一种CAR
‑
T细胞的培养体系，包括基础培养体系和亚精胺；
[0005]所述基础培养体系包括：X
‑
vivo无血清培养体系、青霉素、链霉素和IL
‑
2，所述基础培养体系中还包括胎牛血清或自体血浆。
[0006]优选的，所述基础培养体系中青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100μg/ml，IL
‑
2的浓度为200U/ml，胎牛血清或自体血浆的终浓度为所述基础培养体系的10％。
[0007]优选的，所述亚精胺的工作浓度为0.5～500μM。
[0008]优选的，所述亚精胺的工作浓度为0.5～5μM。
[0009]本专利技术还提供了上述培养体系在制备提高CAR
‑
T细胞体内外杀伤肿瘤能力、增殖能力、细胞因子表达水平和记忆表型转化的细胞培养基中的应用。
[0010]本专利技术还提供了上述培养体系在制备缓解CAR
‑
T细胞耗竭状态的培养基中的应用。
[0011]本专利技术还提供了一种CAR
‑
T细胞的扩增方法，包括以下步骤：将构建得到的CAR
‑
T细胞转入上述培养体系中进行扩增培养4d。
[0012]优选的，包括将含目标CAR序列的慢病毒侵染T细胞72h，验证阳性后进行所述扩增培养。
[0013]有益效果：本专利技术提供了一种CAR
‑
T细胞的培养体系，相较于基础培养体系，亚精
胺可以增强CAR
‑
T细胞的体内外杀伤淋巴瘤细胞活性，并改变其生物学特性，如改善CAR
‑
T细胞的增殖能力，细胞因子表达水平，记忆表型转化。在本专利技术实施例中，当向基础培养体系中补充亚精胺后，对CAR
‑
T细胞进行扩增，其增殖能力提升，耗竭状态改善，记忆性表型群体增加，同时，细胞因子分泌能力增加，对淋巴瘤细胞的裂解能力增加。此外，淋巴瘤小鼠的生存得到延长。
附图说明
[0014]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0015]图1为不同浓度亚精胺处理下T细胞凋亡情况；
[0016]图2为流式细胞术检测不同浓度亚精胺处理下T细胞增殖情况；
[0017]图3为绝对计数法检测不同浓度亚精胺处理下T细胞增殖情况；
[0018]图4为CD19 CAR
‑
T细胞的阳性率；
[0019]图5为Nb CAR
‑
T细胞的阳性率；
[0020]图6为亚精胺处理下CD19 CAR
‑
T细胞记忆表型情况；
[0021]图7为亚精胺处理下Nb CAR
‑
T细胞记忆表型情况；
[0022]图8为亚精胺处理下CD19 CAR
‑
T细胞增殖情况；
[0023]图9为亚精胺处理下Nb CAR
‑
T细胞增殖情况；
[0024]图10为亚精胺处理下CD19 CAR
‑
T细胞IL
‑
2分泌情况；
[0025]图11为亚精胺处理下CD19 CAR
‑
T细胞IFN
‑
γ分泌情况；
[0026]图12为亚精胺处理下Nb CAR
‑
T细胞IL
‑
2分泌情况；
[0027]图13为亚精胺处理下Nb CAR
‑
T细胞IFN
‑
γ分泌情况；
[0028]图14为亚精胺处理下CD19 CAR
‑
T细胞毒性；
[0029]图15为亚精胺处理下Nb CAR
‑
T细胞毒性；
[0030]图16为各处理组小鼠腹侧肿瘤负荷；
[0031]图17为各处理组小鼠背侧肿瘤负荷；
[0032]图18为各处理组小鼠体重变化情况；
[0033]图19为各处理组小鼠身存曲线；
[0034]图20为亚精胺预处理CAR
‑
T细胞示意图。
具体实施方式
[0035]本专利技术提供了一种CAR
‑
T细胞的培养体系，包括基础培养体系和亚精胺；
[0036]所述基础培养体系包括：X
‑
vivo无血清培养体系、青霉素、链霉素和IL
‑
2，所述基础培养体系中还包括胎牛血清或自体血浆。
[0037]本专利技术所述基础培养体系中，青霉素的浓度优选为100U/ml，链霉素的浓度优选为100μg/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CAR
‑
T细胞的培养体系，其特征在于，包括基础培养体系和亚精胺；所述基础培养体系包括：X
‑
vivo无血清培养体系、青霉素、链霉素和IL
‑
2，所述基础培养体系中还包括胎牛血清或自体血浆。2.根据权利要求1所述培养体系，其特征在于，所述基础培养体系中青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100μg/ml，IL
‑
2的浓度为200U/ml，胎牛血清或自体血浆的终浓度为所述基础培养体系的10％。3.根据权利要求1所述培养体系，其特征在于，所述亚精胺的工作浓度为0.5～500μM。4.根据权利要求1或3所述培养体系，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐广贤，王红霞，官成浓，蒋丹，张爱君，楚元奎，张晓春，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：