【技术实现步骤摘要】
用于构建HNF1A基因突变的糖尿病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
[0001]本专利技术属于生物
,具体属于基因编辑
,更具体涉及CRISPR/Cas9系统及ssODN同源重组技术在构建HNF1A基因突变的糖尿病模型猪核移植供体细胞中的应用。
技术介绍
[0002]单基因糖尿病是由在胰岛β细胞发育、功能或胰岛素信号通路中起关键作用的单个基因突变导致的一种特殊类型糖尿病,约占所有类型糖尿病的1%
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5%。按临床症状的发病年龄不同,单基因糖尿病可分为两大类:新生儿糖尿病(neonatal diabetes mellitus,NDM)及青少年起病的成人型糖尿病(maturity onset diabetes of the young,MODY)。单基因糖尿病临床特征多样,大多数MODY的临床表现与2型糖尿病相似,而由ATP敏感的钾通道(Kcnj11)或胰岛素(Ins)等基因突变导致的NDM的临床表现类似于1型糖尿病。研究显示,有约90%的单基因糖尿病患者都被误诊为1型或2型糖尿病,但是,由于单基因糖尿病的临床预后、转归和治疗方案的选择等,与1型和2型糖尿病有很大差别,目前有近70%患者没有得到正确有效的治疗方案。由于突变基因不同,单基因糖尿病临床特征各不相同,目前已发现有至少14种基因的突变可导致MODY,其中,MODY3、MODY2和MODY1最为常见,占所有单基因糖尿病患者的90%以上。
[0003]MODY3型糖尿病是由编码肝细胞核因子1
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α(HN ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种制备重组细胞的方法,包括如下步骤:用SEQ ID NO:18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO:19所示的DNA分子,得到重组细胞。2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:用SEQ ID NO:18所示的DNA分子取代猪细胞的染色体DNA中SEQ ID NO:19所示的DNA分子的实现方式为:将HNF1A
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gU2、HNF1A
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gD1、HNF1A
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mutant
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ss163和NCN蛋白共转染猪细胞;所述HNF1A
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gU2为sgRNA,其靶序列结合区如SEQ ID NO:16中第3
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22位核苷酸所示;所述HNF1A
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gD1为sgRNA,其靶序列结合区如SEQ ID NO:17中第3
‑
22位核苷酸所示;所述HNF1A
‑
mutant
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ss163为SEQ ID NO:18所示的单链DNA分子;所述NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白。3.如权利要求2所述的方法,其特征在于:所述NCN蛋白如SEQ ID NO:3所示。4.如权利要求2或3所述的方法,其特征在于:猪细胞、HNF1A
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gU2、HNF1A
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gD1、HNF1A
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mutant
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ss163和NCN蛋白的配比依次为:10万个猪细胞:0.8
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1.2μg HNF1A
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gU2:0.8
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1.2μg HNF1A
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gD1:1.8
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2.2μg HNF1A
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mutant
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ss163:3
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5μg NCN蛋白。5.如权利要求3所述的方法,其特征在于:所述NCN蛋白的制备方法包括如下步骤:(1)将质粒pKG
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GE4导入大肠杆菌BL21(DE3),得到重组菌;(2)采用液体培养基30℃培养所述重组菌,然后加入IPTG并25℃诱导培养,然后收集菌体;(3)将收集的菌体进行菌体破碎,收集粗蛋白溶液;(4)采用亲和层析从所述粗蛋白溶液中纯化具有His6标签的融合蛋白;(5)采用具有His6标签的肠激酶酶切具有His6标签的融合蛋白,然后采用Ni
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NTA树脂去除具有His6标签的蛋白,得到纯化的NCN蛋白;质粒pKG
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GE4中具有SEQ ID NO:1中第5209
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9852位核苷酸所示的融合基因。6.一种试剂盒,包括HNF1A
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gU2、HNF1A
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gD1、HNF1A
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mutant
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ss163和NCN蛋白;HNF1A
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gU2为权利要求2中所述的HNF1A
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gU2;HNF1A
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gD1为权利要求2中所述的HNF1A
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gD1;HNF1A
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mutant
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ss163为权利要求2中所述的HNF1A
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mutant
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ss163;NCN蛋白为权利要求2或3或5中所述的NCN蛋白;所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c):(a)制备重组细胞;(b)制备糖尿病模型猪;(c)制备糖尿病细胞模型或糖尿病组织模型或糖尿病器官模型。7.一种试剂盒,包括HNF1A
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gU2、HNF1A
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gD1、HNF1A
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mutant
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ss163和PRONCN蛋白;HNF1A
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gU2为权利要求2中所述的HNF1A
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gU2;HNF1A
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gD1为权利要求2中所述的HNF1A
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gD1;HNF1A
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mutant
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ss163为权利要求2中所述的HNF1A
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mutant
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ss163;所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件:信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号;所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c):(a)制备重组细胞;(b)制备糖尿病模型猪;(c)制备糖尿病细胞模型或糖尿病组织模型或糖尿病器官模型。8.一种试剂盒,包括HNF1A
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gU2、HNF1A
...
【专利技术属性】
技术研发人员:牛冬,汪滔,段星,刘璐,马翔,陶裴裴,曾为俊,王磊,程锐,赵泽英,黄彩云,
申请(专利权)人:南京启真基因工程有限公司,
类型:发明
国别省市:
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