一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞及其制备方法、应用技术

本发明专利技术公开了一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞及其制备方法、应用，本发明专利技术提出血清铁离子能够诱发免疫细胞发生铁死亡，并进一步在免疫细胞制备工艺中证实铁离子对免疫细胞的毒性作用；因此，在免疫细胞产品制备中添加铁死亡抑制剂，增加了其对铁离子毒性的抵抗作用，并促进了免疫细胞在体内对肿瘤的治疗效果，延长了荷瘤小鼠的生存时间。本发明专利技术提出铁死亡对免疫细胞的胁迫作用，优化了免疫细胞产品的制备工艺。品的制备工艺。品的制备工艺。

【技术实现步骤摘要】
一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞及其制备方法、应用


[0001]本专利技术涉及嵌合抗原受体T(CAR
‑
T)细胞的产品制备，尤其涉及一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞及其制备方法、应用。

技术介绍

[0002]嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor T
‑
cell therapy，CAR
‑
T)是一种新型的免疫靶向治疗技术，通过基因工程修饰T淋巴细胞并嵌入CAR基因，使其在体内特异性地识别并攻击恶性肿瘤，被认为是最具临床应用前景的细胞免疫疗法。尽管疗效显著，但仍有10％
‑
50％病人在治疗后疾病复发。这是由于患者体内CAR
‑
T细胞的扩增效率、杀伤能力以及存活时间存在个体差异造成的。因此，提高CAR
‑
T细胞持久性及杀伤功能成为了亟需解决的技术问题。
[0003]铁死亡最早被定义于2012年，是铁离子依赖性的调节性死亡，其本质是细胞膜磷脂发生脂质过氧化，造成膜破裂而导致的细胞死亡。形态上，铁死亡的细胞表现出典型的坏死性形态，并伴随同质异形的小线粒体：嵴减少、膜凝聚、外膜破裂。铁死亡的主要诱因这是细胞内游离二价铁的过渡积累。细胞内游离的二价铁离子氧化性极强,容易与H2O2发生芬顿反应(Fenton reaction),产生能对DNA、蛋白质和膜磷脂造成氧化损伤的羟基自由基,从而促进磷脂的组分—多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，引起膜破裂导致细胞死亡。
[0004]因此，亟需提供一种免疫细胞的制备方法，通过铁死亡抑制剂增加免疫细胞持续性及杀伤功能。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术不足，提出了一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞及其制备方法、应用。
[0006]为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案为：本专利技术实施例的第一方面提供了一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞的制备方法，具体为：分离培养免疫细胞，并在免疫细胞培养过程中添加浓度为0
‑
4μM铁死亡抑制剂，其中免疫细胞的量为5*10E5/kg
‑
4*10E6/kg。
[0007]进一步地，所述铁死亡抑制剂为包括Ferrostatin
‑
1、UAMC
‑
3203、Liproxstatin
‑
1在内的对铁死亡有抑制作用的抑制剂。
[0008]进一步地，铁死亡抑制剂Ferrostatin
‑
1的添加浓度为1
‑
4μM，铁死亡抑制剂UAMC
‑
3203和铁死亡抑制剂Lip
‑
1的添加浓度为0
‑
200nM。
[0009]进一步地，所述免疫细胞具有杀伤功能的免疫细胞；所述免疫细胞为T细胞、NK细胞、巨噬细胞中的一种或多种按任意比例混合。
[0010]进一步地，所述T细胞为CAR
‑
T细胞或TCR
‑
T细胞中的一种或两种按任意比例混合。。
[0011]进一步地，在免疫细胞培养过程中添加浓度为0
‑
4μM铁死亡抑制剂具体为：在免疫细胞培养0
‑
12天每天都加入铁死亡抑制剂、在免疫细胞培养0
‑
12天过程中按单位时间间断
地加入铁死亡抑制剂或在免疫细胞培养0
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12天后加入铁死亡抑制剂。
[0012]本专利技术实施例的第二方面提供了一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞，由上述的制备方法制得。
[0013]本专利技术实施例的第三方面提供了一种上述的免疫细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0014]进一步地，所述肿瘤为血液肿瘤、神经胶质细胞瘤中的一种。
[0015]本专利技术实施例的第四方面提供了一种抗肿瘤药物，包含上述的免疫细胞。
[0016]本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞及其制备方法、应用，该方法简单易行，通过在免疫细胞培养过程中添加铁死亡抑制剂能够明显的增加免疫细胞持续性及杀伤功能，很大程度上解决了细胞治疗过程中的复发问题，为延长病人的生存期提供保证。
附图说明
[0017]图1中的A为CAR
‑
T培养过程中添加20μM，50μM铁离子后细胞计数增殖曲线；图1中的B为CCK8试剂盒在加铁离子后24小时、48小时细胞增殖能力检测；
[0018]图2中的A、B为加铁离子后T细胞亚群分化比例变化，图2中的C、D为比例变化统计图；
[0019]图3为CAR
‑
T培养过程中添加20μM，50μM铁离子后细胞进行流式检测PD1、LAG3、TIM3耗竭指标的表达变化；
[0020]图4为CAR
‑
T培养过程中添加20μM，50μM铁离子后细胞与肿瘤细胞按照1:2，1:4的比例混合，在6小时、12小时的细胞杀伤结果检测图；
[0021]图5中的A为NSG小鼠在低中高三种铁离子含量不同饲料喂养后的CAR
‑
T体内治疗效果图；图5中的B为小鼠体内肿瘤细胞荧光值；C图5中的为小鼠生存曲线；
[0022]图6为图5的小鼠模型体内CAR
‑
T亚群、耗竭功能指标检测；
[0023]图7中的A、B、C分别为三种铁死亡抑制剂在CAR
‑
T细胞制备中的计数曲线；
[0024]图8中的A为铁死亡抑制剂Fer
‑
1对CAR
‑
T细胞亚群分化的促进作用；图8中的B为统计结果。图8中的C、D、E为耗竭指标表达变化；
[0025]图9中的A为铁死亡抑制剂Lip
‑
1对CAR
‑
T细胞亚群分化的促进作用；图9中的B为统计结果。图9中的C、D、E为耗竭指标表达变化；
[0026]图10中的A为铁死亡抑制剂UAM对CAR
‑
T细胞亚群分化的促进作用；图10中的B为统计结果。图10中的C、D、E为耗竭指标表达变化；
[0027]图11为三种铁死亡抑制剂添加CAR
‑
T细胞后，铁死亡相关基因表达变化；
[0028]图12中的A为NSG小鼠在三种新型CAR
‑
T治疗中的表现；图12中的B为生存曲线；图12中的C为肿瘤体内负荷荧光值。
具体实施方式
[0029]这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本专利技术相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附
权利要求书中所详述的、本专利技术的一些方面相一致的装置和方法的例子。
[0030]在本专利技术使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本专利技术。在本专利技术和所附权利要求本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞的制备方法，其特征在于，具体为：分离培养免疫细胞，并在免疫细胞培养过程中添加浓度为0
‑
4μM铁死亡抑制剂，其中免疫细胞的量为5*10E5/kg
‑
4*10E6/kg。2.根据权利要求1所述的基于铁死亡抑制剂的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述铁死亡抑制剂为包括Ferrostatin
‑
1、UAMC
‑
3203、Liproxstatin
‑
1在内的对铁死亡有抑制作用的抑制剂。3.根据权利要求2所述的基于铁死亡抑制剂的免疫细胞的制备方法，其特征在于，铁死亡抑制剂Ferrostatin
‑
1的添加浓度为1
‑
4μM，铁死亡抑制剂UAMC
‑
3203和铁死亡抑制剂Lip
‑
1的添加浓度为0
‑
200nM。4.根据权利要求1所述的基于铁死亡抑制剂的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述免疫细胞具有杀伤功能的免疫细胞；所述免疫细胞为T细胞、NK细胞、巨噬细胞中的一种或...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄河，孔德麟，荆瑞瑞，杨婷婷，赵梦雨，张琪琦，杨琳，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，
类型：发明
国别省市：