将单个核细胞直接重编程为诱导性间充质干细胞的方法技术

间充质干细胞(MSC)在细胞治疗和再生医学领域中具有广阔的应用前景。在本发明专利技术中，我们公开了一种新型的直接重编程方法用以制备诱导性间充质干细胞(iMSC)，通过利用游离型载体过表达五种重编程因子OCT4、SOX9、MYC、KLF4和BCL

【技术实现步骤摘要】
将单个核细胞直接重编程为诱导性间充质干细胞的方法


[0001]本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种将人外周血来源的单个核细胞直接重编程为诱导性间充质干细胞的方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(MSC)在再生医学和细胞治疗领域有重要应用前景，其治疗效果在全球范围内的1300多项临床试验中已经得到了可靠的验证。然而，由于细胞异质性、效力不均一、数目有限以及在体外扩增过程中细胞衰老较快，其在临床应用中仍然面临许多争议和挑战。因此，建立一种可产生大量效力一致的MSC尤其是自体MSC的方法，并使用可靠的分子标志物进行质量控制，将大大有益于促进MSC在临床中的应用。
[0003]外周血细胞目前已被广泛应用于重编程产生诱导性多能干细胞(iPSC)，究其原因可总结为以下两点：一是采血过程简单便捷，且创伤较小，使得血液成为人体中最容易获得的细胞来源；二是与成纤维细胞相比，血细胞不太可能产生由环境损伤引起的基因突变，从而具有潜在的安全优势。细胞重编程常用的逆转录病毒载体或慢病毒载体可能会引起插入突变，从而带来安全问题。游离型载体是非整合性质粒，目前已成功用于将成纤维细胞或血细胞重编程为无转基因和无病毒元件的iPSC，将重编程细胞连续培养约5代后，游离型质粒成分就已检测不到。在之前的研究中，为了提高血细胞中重编程因子的表达，我们对游离型载体进行了结构修饰，包括使用脾脏病灶形成病毒启动子(SFFV)和土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)，使细胞重编程效率提高了10到100倍。
[0004]基于过去对细胞重编程方法的研究，OCT4已被认定是将体细胞重编程为诱导性多能干细胞的关键因子。我们之前报道了用修饰的游离型载体瞬时过表达OCT4可直接将人脐血来源的CD34
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细胞重编程为具有三系分化潜能的诱导性间充质干细胞(iMSC)。基于脐带血来源有限，我们也试图构建一种新型的利用游离型载体将人外周血来源的单个核细胞(PBMC)重编程为iMSC的方法。
[0005]我们首先尝试使用临床相关的载体系统单独过表达OCT4是否能将人PBMC重编程为iMSC。我们将分离得到的人PBMC在红细胞培养基中培养六天以扩增红系祖细胞，之后用改进的基于oriP/EBNA1的游离型载体对扩增得到的2x106个细胞进行核转染，该载体在强SFFV启动子下可表达OCT4，再将细胞在添加重编程小分子的MSC培养基中进行培养。但连续培养两周后我们依然没有观察到任何类似MSC的集落形成，这表明单独过表达OCT4不足以将人PBMC直接重编程为iMSC。因此，早期针对人脐血来源的CD34
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细胞重编程为iMSC的方法不再适用于人外周血，亟需开发新型的可将人外周血来源的PBMC直接重编程为iMSC的方法。

技术实现思路

[0006]本公开提供了一种将人外周血来源的单个核细胞直接重编程为诱导性间充质干细胞的方法，且重编程后的细胞能够表达典型的MSC表面标志物，同时具有分化为成骨细
胞、脂肪细胞和软骨细胞的三系分化潜能。本专利技术至少在一定程度上解决了将人外周血来源的PBMC直接重编程为iMSC。
[0007]本公开的其他特性和优点将通过下面的详细描述变得显然，或部分地通过本公开的实践而习得。
[0008]在本公开的一个实施例中，所述单个核细胞来源于人体外周血。
[0009]在本公开的一个实施例中，重编程载体为游离型质粒载体，也可使用其他可替代的非整合型载体。
[0010]在本公开的一个实施例中，重编程载体的骨架来自EBNA/oriP游离型载体质粒。
[0011]在本公开的一个实施例中，重编程因子包括OCT4、SOX9、MYC、KLF4以及BCL
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XL。
[0012]在本公开的一个实施例中，由脾脏病灶形成病毒启动子SFFV启动重编程因子的表达。
[0013]在本公开的一个实施例中，在载体中加入土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件wpre，对重编程因子进行转录后调控。
[0014]在本公开的一个实施例中，重编程因子SOX9还可用SOX2替代，但SOX2可能导致重编程产生少量诱导性多能干细胞(iPSC)从而带来安全隐患。
[0015]在本公开的一个实施例中，OCT4、BCL
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XL和MYC重编程因子缺少其中任意一种都无法形成iMSC集落。
[0016]在本公开的一个实施例中，利用电穿孔方法完成将单个核细胞直接重编程为诱导性间充质干细胞。
[0017]本公开的实施例提供了一种新型的直接重编程方法，实现了将人外周血来源的单个核细胞直接重编程为iMSC。
附图说明
[0018]此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。在附图中：
[0019]图1为本专利技术中重编程方法涉及到的游离型载体示意图；
[0020]图2为本专利技术中将PBMC直接重编程为iMSC集落的展示图；
[0021]图3为本专利技术重编程得到的iMSC流式分析示意图；
[0022]图4为本专利技术使用OCT4、BCL
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XL和MYC(OBM)因子组合对2x106个PBMC重编程14天后的集落形成情况的示意图；
[0023]图5为本专利技术不同重编程因子组合条件下的重编程效率示意图；
[0024]图6为本专利技术不同因子组合条件下重编程8天后对iMSC进行流式分析示意图；
[0025]图7为本专利技术五因子组合或去除其中某一因子组合条件下的重编程效率示意图；
[0026]图8为本专利技术在转染5F、4FnoO(无OCT4)或4FnoK(无KLF4)后2、3和4周对MSC标志物CD73和CD90进行流式分析示意图；
[0027]图9为本专利技术在5F、4FnoO和4FnoK条件下重编程得到的iMSCs三系分化结果示意图；
[0028]图10为本专利技术用5F、4FnoO或4FnoK重编程的iMSC的多向分化示意图。
具体实施方式
[0029]在本公开的一个实施例中，单个核细胞来源于人体外周血。
[0030]在本公开的一个实施例中，重编程载体为游离型质粒载体。
[0031]在本公开的一个实施例中，载体的骨架来自EBNA/oriP游离型载体质粒。
[0032]在本公开的一个实施例中，重编程因子包括OCT4、SOX9、MYC、KLF4以及BCL
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XL。
[0033]在本公开的一个实施例中，由脾脏病灶形成病毒启动子SFFV启动重编程因子的表达。
[0034]在本公开的一个实施例中，在载体中加入土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件wpre，对重编程因子进行转录后调控。
[0035]在本公开的一个实施例中，重编程因子SOX本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.将单个核细胞直接重编程为诱导性间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：重编程得到的细胞能够表达典型的间充质干细胞表面标志物，并具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的三系分化潜能。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单个核细胞来源于人体外周血。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，重编程载体包括游离型质粒载体以及非整合型载体。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述游离型载体骨架来自EBV核抗原(EBNA)/顺式作用复制起点(oriP)游离型载体质粒。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，重编程因子包括八聚体结合转录因子(OCT4)、性别决定区Y框蛋白9(SOX9)、原癌基因bHLH转录因子(MYC)、Kruppel样因子4(KLF4)以及抗凋亡蛋白B...

【专利技术属性】
技术研发人员：张孝兵，
申请(专利权)人：苏州吉纳星辰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：