本公开提供了将RNA构建体递送至细胞以进行功能性表达和/或活动的方法和组合物。在一些方面，本公开提供了一种包含多功能化纳米颗粒的组合物。所述多功能化纳米颗粒包含用至少一个RNA分子、至少一种细胞穿透肽(CPP)和至少一个带正电荷的部分功能化的核，其中每一个都任选地用接头部分独立地附着至所述核。在一些实施方案中，所述RNA分子是未加帽mRNA分子，其5'端附着至接头部分，所述接头部分附着至所述核。所述多功能化纳米颗粒基本上是不带电荷的、带负电荷或带正电荷的。所述多功能化纳米颗粒可用于为各种目的在细胞中递送所关注多肽并使其表达的方法中，所述目的包括疫苗接种、癌症治疗、端粒延长、细胞信号传导通路的修饰等。饰等。饰等。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于表达所关注基因和/或调控信号传导通路的纳米颗粒
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年1月10日提交的美国临时申请第62/959,790号和2020年1月13日提交的美国临时申请第62/960626号的权益，其中每件申请都明确地以全文引用的方式并入本文。
[0003]本公开涉及组合物及其使用和制造的相关方法，所述组合物使用生物活性分子功能化的纳米颗粒控制基因产物的基因表达和活性，所述生物活性分子包括但不限于肽、蛋白质、小RNA分子(例如小干扰RNA(siRNA))和较长的RNA分子(如信使RNA(mRNA))。
技术介绍
[0004]细胞正常增殖、迁移和分化为各种细胞类型的能力对于胚胎发生和成熟细胞(包括但不限于心血管系统、免疫系统、肠道系统和脑系统的细胞)的功能至关重要。由于获得性或遗传性突变，细胞的这种功能能力在各种病理条件下会发生改变，这可能激活不同细胞内信号传导通路和过度表达各种基因(例如致癌基因)，每一种都可能造成恶性细胞的恶性转化、过度增殖和扩增。
[0005]此外，细胞正常功能所需的一些重要基因(例如肿瘤抑制基因)表达的异常缺失也可能引发过度增殖，这种功能缺失可能造成不同肿瘤和癌症的恶性转化和发展。
[0006]此外，在病毒感染期间，新基因和/或改变的基因(病毒来源基因或由病毒DNA整合到宿主细胞基因组中触发或从病毒RNA表达的新生突变的产物)在细胞中表达并有助于病毒复制，这可能导致各种严重的，有时甚至危及生命的并发症。尽管免疫系统通常可以有效地对抗某些病毒感染，但疫苗接种是世界范围内常用以使生物体更有效地抵抗和对抗感染的方法。然而，疫苗接种通常基于使用部分或完全灭活的含DNA的病毒。每次将外源性DNA与细胞一起使用时，此类DNA都会整合到细胞基因组中，并可能引发肿瘤形成和/或其他有害后果。因此，使用保持细胞基因组完全不变的蛋白质或mRNA的非DNA疫苗接种代表了更优选的疫苗接种途径。
[0007]最近的科学发展提出了各种方法来控制类致癌基因分子的异常表达，包括施用外源性小分子抑制剂、小干扰RNA(siRNA)、miRNA或信使RNA(mRNA)。此外，病毒基因特异性mRNA可用于疫苗接种，以诱导病毒基因产物的表达，并训练免疫系统细胞产生抗病毒抗体。然而，有效使用siRNA、miRNA、mRNA和其他基于RNA分子的主要障碍是缺少能够将siRNA穿过细胞膜转运到各种人体细胞细胞质的高效递送媒介物。同样的问题也阻碍了基因的恢复，在恶性转化和肿瘤形成过程中基因的表达会丢失。
[0008]因此，尽管本领域已取得进步，但仍然需要一种有效的方法来将生物活性分子单独或以各种组合形式递送到细胞内部以有效诱导调节基因表达。例如，仍然需要靶向一种或更多种不同的异常信号转导通路和/或诱导所关注靶基因在各种细胞中的表达，同时避免对染色体结构造成损害。本公开实现了这些方面并满足了相关的需要。
技术实现思路
[0009]在一些方面，本公开提供了将蛋白质、肽、siRNA、微RNA和mRNA与生物相容性纳米颗粒连接以调节细胞功能的功能化和制造方法。在一些方面，本专利技术涉及所述多功能化的生物相容性纳米颗粒本身。在另一些实施方案中，本公开涉及使用所公开的多功能化生物相容性纳米颗粒的方法。在其他方面，本公开提供了所述多功能化纳米颗粒，以及包含其的组合物、试剂盒和细胞。
[0010]当结合附图参考以下详细的说明书时，本公开的这些方面和其他方面对于本领域普通技术人员将变得更加显而易见。
附图说明
[0011]当结合附图参考以下详细的说明书时，本专利技术的前述方面和许多附带优势将变得更容易让人明白，因为它们变得更好理解，其中：
[0012]图1显示人类原代成纤维细胞的两张照片，表明了本公开示例性多功能化纳米颗粒对于在原代细胞中基因特异性siRNA分子的细胞质递送非常有效。左图示出了用不含siRNA纳米颗粒处理的对照人类原代成纤维细胞。右图示出了用FITC标记纳米颗粒处理的人类原代成纤维细胞，然后进行大量洗涤以去除未结合的纳米颗粒，这些纳米颗粒用靶向肿瘤抑制基因PT10的生物活性肽和siRNA构建体进行多功能化。细胞核用DAPI染色。标示的荧光(参见显示示例性荧光信号的箭头)表明了在细胞质中存在PTEN特异性siRNA功能化的纳米颗粒，将靶PT10基因表达敲低60％，这通过qRT
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PCR进行测定。
[0013]图2显示人类原代成纤维细胞的两张照片，表明了本公开示例性多功能化纳米颗粒对于在细胞中递送和翻译mRNA非常有效。左图显示了暴露于不含mRNA纳米颗粒的对照人类原代成纤维细胞。右图显示了用编码红色mCherry蛋白的未加帽mRNA功能化的NP处理的细胞。在处理后26小时评估通过红色荧光(参见显示示例性荧光信号的箭头)测定的mCherry mRNA表达。标示的荧光证实了由所述多功能化纳米颗粒递送的mRNA(包括未加帽mRNA)，可以成功地有效翻译mRNA有效载荷。
具体实施方式
[0014]本公开的基础是专利技术人对基于纳米颗粒的有效递送机制的开发，该递送机制有效地促进将一种或更多种不同来源的生物活性分子(包括siRNA、miRNA、mRNA、肽和蛋白质)非整合递送到各种细胞类型中。RNA构建体表现出高功能性，但仍使细胞基因组保持不变。该平台可以与多种生物活性有效载荷复用，以同时靶向例如多种通路，并提供高效调控靶基因表达的新方法。该平台可适用于多种应用，包括实施强化疫苗接种、促进端粒延长、有效治疗人体恶性肿瘤、控制引起各种病理状况的基因表达等。
[0015]为了在细胞内递送生物活性分子，本公开提供了一种基于组合物的通用平台，所述组合物包括细胞膜穿透纳米颗粒，其具有共价连接的各种来源生物活性分子。为此，本公开在本文中提出了一种新功能化方法，确保蛋白质、肽和不同RNA与纳米颗粒的共价连接。本专利技术的修饰的细胞渗透性纳米颗粒提供了一种通用机制，用于同时向细胞内递送生物活性分子以调控细胞功能和/或使细胞功能正常化，该机制随后可用于研究和开发、药物筛选和治疗应用以改善人体细胞或器官功能和/或人体对感染的抵抗力。
[0016]根据前述内容，一方面，本公开提供了一种组合物，被构造成将RNA有效载荷递送至细胞内部。所述组合物包含多功能化纳米颗粒核，其用以下进行功能化：
[0017]至少一个RNA分子，通过接头附着至所述固体纳米颗粒核，
[0018]至少一种带正电荷的细胞穿透肽(CPP)，附着至所述固体纳米颗粒核；其中所述功能化纳米颗粒基本上是不带电荷、带负电荷或带正电荷的。
[0019]所述纳米颗粒核优选是生物相容的，包括例如超顺磁性氧化铁纳米颗粒或金纳米颗粒或聚合生物可降解纳米颗粒，类似于先前在科学文献中描述的纳米颗粒(勒温(Lewin)M等人,《自然生物技术》(Nat.Biotech.)2000,18,410
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414；申(Shen)T等人,《医学科学中的磁共振》(Magn.本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，包含：用以下进行功能化的固体纳米颗粒核：至少一个RNA分子，通过第一接头附着至所述固体纳米颗粒核，至少一种细胞穿透肽(CPP)，附着至所述固体纳米颗粒核；和至少一个带正电荷的部分，连接到所述固体纳米颗粒核；其中所述功能化纳米颗粒基本上是不带电荷、带负电荷或带正电荷的。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述固体纳米颗粒核是金属的或非金属的。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述纳米颗粒核是超顺磁性的。4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述固体纳米颗粒核包含铁、金或如说明书所述的其他金属。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的组合物，其中所述固体纳米颗粒核的直径尺寸为50nm或更小。6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述RNA分子是具有5'端和3'端的未加帽mRNA分子，其中所述未加帽mRNA分子的5'端与所述第一接头共价结合。7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述RNA分子是具有5'端和3'端的加帽mRNA分子，其中所述加帽mRNA分子的3'端与所述第一接头共价结合。8.根据权利要求6或7所述的组合物，其中所述mRNA分子的长度为至少约150个核苷酸。9.根据权利要求6或7所述的组合物，其中所述mRNA分子编码所关注的抗原。10.根据权利要求6或7所述的组合物，其中所述mRNA分子编码所关注的酶。11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述mRNA分子编码端粒酶。12.根据权利要求6或7所述的组合物，其中所述mRNA分子编码可检测蛋白质标志物。13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一接头是线性接头。14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一接头是具有与所述固体纳米颗粒核的单触点和多个分支的分支接头，其中所述多个分支中的至少两个附着至单独的RNA分子。15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一接头的长度为至少6埃。16.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一接头是可切割接头。17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述可切割接头被构造成在细胞内被切割。18.根据权利要求16或17所述的组合物，其中所述可切割接头包含二硫键。19.根据权利要求16
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18中任一项所述的组合物，其中所述可切割接头是酸不稳定的或其他类型的接头。20.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种CPP通过第二接头附着至所述固体纳米颗粒核，其中所述第一接头和所述第二接头相同或不同。21.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：斯特姆詹尼克斯公司，
类型：发明
国别省市：
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