一种高产安丝菌素P-3的菌株及其应用制造技术

本发明专利技术属于微生物制药领域，提供了一种高产安丝菌素P

【技术实现步骤摘要】
一种高产安丝菌素P
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3的菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物制药领域，具体地涉及一种高产安丝菌素P
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3的菌株及其应用。

技术介绍

[0002]安丝菌素(ansamitocin)是一种美登素类抗生素，母核为19
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C的大环内酰胺环，按C
‑
3连接不同长度的碳链，可分为AP
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0，AP
‑
1、AP
‑
2、AP
‑
3、AP
‑
4和AP
‑4’
。安丝菌素P
‑
3(AP
‑
3)经过特定化学修饰之后可以合成一种化学小分子美登素Mertansine(DM1)。DM1是一种微管蛋白抑制剂，也是一种抗体可缀合的美登木素生物碱，用于克服与美登素相关的全身毒性并增强肿瘤特异性递送。DM1通过连接体连接到单克隆抗体上，形成抗体药物结合物(ADC)，比如全球首个应用于实体瘤的抗体药物偶联剂T
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DM1，由靶定乳腺癌的抗体曲妥珠单抗结合微管抑制剂美登素衍生物DM1(trastuzumab
‑
DM1)通过连接子偶联而成，具有靶向性和细胞毒杀伤双重抗肿瘤作用。早在2013年2月已经获美国FDA批准用于治疗已经接受过曲妥珠单抗和一线紫杉烷类化疗无效的HER2阳性晚期乳腺癌患者。
[0003]安丝菌素P
‑
3结构稳定、疏水性强易于萃取，是合成美登素的最佳前体，其制备方法主要有微生物发酵法、前体诱导法、化学合成、半合成等途径。因美登木素结构复杂存在全合成和半合成工艺复杂、过程繁琐、产率很低、反应专一性差等缺点；微生物发酵法具有污染低，生产不受地域限制等特点，因而是目前较为常用的方法。通常珍贵橙色束丝放线菌表达的安丝菌素总量一般在10
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50mg/L，AP
‑
3占比一般不到50％。CN102732581B提供了一种珍贵橙色束丝放线菌发酵产生安丝菌素的方法，通过优化发酵培养基的成分及发酵条件可提升安丝菌素P
‑
3的产量，提升后安丝菌素P
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3的表达量最高达到150mg/L左右；CN105907681B提供了一种高产安丝菌素P
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3的突变株及安丝菌素P
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3的制备方法，该方法必须要在补料分批发酵5～7天的情况下，安丝菌素P
‑
3发酵量最高才可达到200mg/L左右。已知的关于束丝放线菌发酵生产安丝菌素的报道中，安丝菌素P
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3产量仍需提高，因此挖掘高产菌株继续提高发酵安丝菌素P
‑
3产量的技术研究仍具有重要价值。

技术实现思路

[0004]本专利技术的一个目的在于提供一种高产安丝菌素P
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3的菌株，其分类命名为珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)，该菌株已于2020年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为：CGMCC NO.21355。
[0005]本专利技术的另一个目的在于提供一种安丝菌素P
‑
3的制备方法，所述制备方法使用了上述高产菌株，其包括以下步骤：
[0006]步骤一：取土壤样，制成土壤混悬液，梯度稀释后，通过含抗高氏培养基培养、菌落生长形态筛选、16s
‑
rDNA菌种鉴定序列、液相分析确定发酵产物，得到产安丝菌素的原始菌株；
[0007]步骤二：将原始菌株经过高氏固体培养基、种子培养基、发酵培养基培养，分离筛
选得到安丝菌素P3产量大于100μg/mL的优化菌株；
[0008]步骤三：将优化菌株通过紫外照射、异丁醇筛选，最后发酵培养，筛选得到安丝菌素产量大于300μg/mL的高产菌株；
[0009]步骤四：将该高产菌株连续培养6代，通过摇瓶检测安丝菌素P
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3产量，鉴定菌种传代稳定性。
[0010]具体地，所述高氏固体培养基成分包含：硝酸钾1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，可溶性淀粉20.0g/L，琼脂20.0g/L，pH值7.2
‑
7.4。
[0011]具体地，所述种子培养基成分包含：可溶性淀粉20g/L，葡萄糖5g/L，黄豆粉20g/L，氯化钠5g/L,磷酸氢二钾5g/L，余量为水，消毒前pH为6.0。
[0012]具体地，所述发酵培养基成分包含：可溶性淀粉20g/L，蔗糖10g/L，棉籽精粉20g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钙5g/L,磷酸氢二钾5g/L，余量为水，消毒前pH为6.0。
[0013]具体地，步骤一中所述含抗高氏培养基培养是指：含有50μg/mL氨苄青霉素钠和25μg/mL的卡那霉素的高氏固体培养基。
[0014]具体地，步骤一中所述根据菌落生长形态筛选的菌落为珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)，其生长形态特征为：起初呈浅黄色，后期颜色逐步变深为橘黄色，菌落近圆形，表面干燥凸起，中央或有开裂，培养7天以后菌落周边可能形成散环形菌丝圈或在表面出现白粉状气生菌丝。
[0015]具体地，步骤一中所述液相分析确定发酵产物是指：将16s
‑
rDNA鉴定验证过的纯化单菌落挑取到种子培养基，28℃、220rpm培养40hr，再以10％的接种量接入发酵培养基，28℃、220rpm培养7～10天。然后取上述发酵液处理后送HPLC检测，与安丝菌素对照品进行对比确认。
[0016]具体地，步骤一中所述液相分析条件为：C18柱(2.7μm 4.6mm*100mm)，检测波长252nm，柱温40℃，流速1.0mL/min，进样体积5μL，流动相为乙腈：水＝42：58。
[0017]具体地，步骤三中所述紫外照射条件为：15W紫外灯下30cm处照射0s～3min(例如30s，1min，3min，不含0s)。
[0018]具体地，步骤三中所述异丁醇筛选指的是：用含有0～0.2％(V:V，不含0)异丁醇的高氏固体培养基培养筛选耐异丁醇的菌株。
[0019]本专利技术还提供了所述珍贵束丝放线菌CMC2003
‑
A3
‑
86在发酵生产安丝菌素P
‑
3中的应用。
[0020]具体地，所述应用是珍贵橙色束丝放线菌CMC2003
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A3
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86的发酵液中可提取安丝菌素P
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3，用于工业生产安丝菌素P
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3。
[0021]本专利技术的有益效果：
[0022]本专利技术提供了一种高产安丝菌素P
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3的菌株及其应用，利用抗性初筛以及16s
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产安丝菌素P
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3的菌株，其特征在于：所述菌株为珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)CMC2003
‑
A3
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86,该菌株于2020年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.21355。2.权利要求1所述的菌株在生产安丝菌素P
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3中的应用。3.一种制备安丝菌素P
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3的方法，其特征在于：将所述珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)CMC2003
‑
A3
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86接种至发酵培养基，发酵培养，获得含安丝菌素P
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3的发酵液，将发酵液经分离纯化，得到所述安丝菌素P
‑
3。4.根据权利要求3所述制备安丝菌素P
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3的方法，其特征在于，所述发酵培养的接种量在5％
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15％。5.根据权利要求3所述制备安丝菌素P
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3的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为缓释碳源、速效碳源、缓释氮源、速效氮源、无机盐及水，消毒前发...

【专利技术属性】
技术研发人员：方丽纳，张薇，朱进伟，张敏，范丹丹，杨永梅，徐金勇，
申请(专利权)人：杭州中美华东制药有限公司，
类型：发明
国别省市：