一种薄荷盾状腺毛富集及内含物鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种薄荷盾状腺毛富集及内含物鉴定方法，属于薄荷盾状腺毛研究领域，该研究方法具体包括四个步骤，S1、采用场发射扫描电镜(SEM)对薄荷叶皮盾状腺毛形态进行观察；S2、密度梯度离心法分离薄荷盾状腺毛；采用密度梯度离心法对薄荷叶片盾状腺毛进行分离和富集，对分离缓冲液组成配比、分离方法进行优化；S3、建立以激光捕获显微切割分离富集薄荷盾状腺毛的方法学体系；S4、对薄荷叶片盾状腺毛进行气相

【技术实现步骤摘要】
一种薄荷盾状腺毛富集及内含物鉴定方法


[0001]本专利技术涉及薄荷盾状腺毛研究领域，特别涉及一种薄荷盾状腺毛富集及内含物鉴定方法。

技术介绍

[0002]腺毛是指植物中能够合成、储存和分泌特定代谢物的毛茸，由单细胞或多细胞构成，被誉为“生物合成工厂”，存在于约30％的维管植物中。近年来，因在植物病虫害防御、抵抗逆境胁迫、减少水分蒸腾以及次生产物开发和利用等方面所起的重要作用，以腺毛为着眼点的药用植物相关研究开始倍受关注。越来越多的工作显示，腺毛的有无及多少与植物次生代谢产物含量密切相关。因此，开展腺毛相关研究对于理清植物次生代谢调控方式及植物遗传谱系整体状态都有重要意义；
[0003]薄荷属于传统常用中药材，为唇形科植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的干燥地上部分，其味辛性凉，具有清利头目、利咽透疹、疏散风热、疏肝行气等功效。目前，对该属植物成分的研究主要集中在挥发性成分上，也就是俗称的“薄荷油”，油中主要成分为单萜类及部分半萜类，其类型为醇、酮、酯、萜烯、萜烷等共10余种。现代药理研究表明，薄荷油具有抗氧化、抗菌、抗辐射、抗癌、降血压等多种生物活性，已被广泛应用于医药、食品、香料和化妆品等领域。
[0004]薄荷叶表面密布腺毛，是分泌和产生薄荷油的主要场所。薄荷油的产生和分泌与薄荷腺毛类型、分布、结构等密切相关。虽然薄荷毛茸中的化学成分研究备受关注，但受腺毛分离及纯化富集手段的限制，该方面研究一直进展缓慢。在较为成熟分离技术出现前，植物体器官常被等同于腺毛来开展实验研究，如采用溶剂直接萃取腺毛内含物，此类方法不可避免地导致腺毛研究具有较高的组织背景，特别是在分子机制研究中，较高的组织背景在一定程度上掩盖了有效信息，给实验结果带来误差。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的在于提供一种薄荷盾状腺毛富集及内含物鉴定方法，可以有效解决
技术介绍
中提到的问题，减少误差。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0007]一种薄荷盾状腺毛富集及内含物鉴定方法，包括该研究方法具体包括四个步骤，分别为：
[0008]S1、采用场发射扫描电镜(SEM)对薄荷叶皮盾状腺毛形态进行观察；
[0009]取干燥薄荷叶片，在叶片基部叶脉周围同一部位取约5mm
×
5mm大小叶片，用导电胶粘附在样品台上，采用离子溅射仪在40mA电流强度下喷金镀膜35s；将喷金镀膜后的样品置于场发射扫描电镜样品仓内，在5～10kV加速电压(EDT)下观察、拍摄腺毛形貌，采用扫描电镜自带测量功能测量并记录腺毛大小；
[0010]S2、密度梯度离心法分离薄荷盾状腺毛；
[0011]采用密度梯度离心法对薄荷叶片盾状腺毛进行分离和富集，对分离缓冲液组成配比、分离方法进行优化；
[0012]S3、建立以激光捕获显微切割分离富集薄荷盾状腺毛的方法学体系；
[0013]S4、对薄荷叶片盾状腺毛进行气相
‑
质谱(GC
‑
MS/MS)检测分析；
[0014]将LMD切割富集到的盾状腺毛，加入适量乙酸乙酯，超声处理10min，上清液过0.22μm滤膜，上机检测。
[0015]优选的，所述S2中的密度梯度离心法具体为：
[0016]研磨器中加入10g新鲜薄荷叶片，再加入200mL分离缓冲液[25mMMOPSO、200mM山梨醇、10mM蔗糖、5mM硫脲、2mM二硫苏糖醇、5mMMgCl2、0.5mM磷酸钠、0.6％(w/v)甲基纤维素、1％(w/v)PVP]，启动研磨器，研磨条件：5次脉冲，20s/每次，每两次研磨时间间隔2～3min，研磨至叶片中肉眼可见无大块碎片；
[0017]将研磨所得匀浆过100μm分子筛，去除残渣，用冲洗液(25mMMOPSO、200mM山梨醇、10mM蔗糖、5mM硫脲、2mM二硫苏糖醇、5mMMgCl2、0.5mM磷酸钠)冲洗残留在分子筛滤网上的叶肉组织，共冲洗3～4次，每次用量5～10mL，洗后的溶液合并到滤液中；
[0018]滤液继续过70μm分子筛，离心，离心条件：4℃，12000rcf，10min；
[0019]离心液弃去上清液后再加入5mL蒸馏水混合，将所得混合液小心加入30mL40％蔗糖溶液顶部，继续离心，离心条件：4℃下，转速650rcf，离心15min，将离心机升速和降速分别设置为5和3。
[0020]优选的，所述S2中的密度梯度离心法具体还可以为：
[0021]研磨器中加入10g新鲜薄荷叶片，再加入200mL分离缓冲液[25mM MOPSO、200mM山梨醇、10mM蔗糖、5mM硫脲、2mM二硫苏糖醇、5mM MgCl2、0.5mM磷酸钠、0.6％(w/v)甲基纤维素、1％(w/v)PVP]，启动研磨器，研磨条件：5次脉冲，20s/每次，每两次研磨时间间隔2～3min，研磨至叶片中肉眼可见无大块碎片；
[0022]将研磨后的匀浆过纱布去除大块残渣，用冲洗液(25mM MOPSO、200mM山梨醇、10mM蔗糖、5mM硫脲、2mM二硫苏糖醇、5mM MgCl2、0.5mM磷酸钠)冲洗纱布3～4次，每次5～10mL，冲洗液与滤液合并，然后依次过100μm、70μm、40μm孔径的分子筛，移取过分子筛后溶液上层液，在4℃、12000rcf条件下离心10min，去除多余水层。
[0023]优选的，所述S3中的方法学体系是以自然干燥薄荷叶片为实验材料，筛选适宜于薄荷盾状腺毛切割的实验条件。
[0024]优选的，所述S4中的检测条件：采用气相质谱联用(GC
‑
MS/MS)技术检测；AgilentDB
‑
5MS色谱柱(30m
×
0.25mm
×
1μm)；流速1.0mL/min；进样口温度：250℃，升温程序：初始温度40℃，以8℃/min升温至260℃，保持2.5min，载气为He；电离方式EI源；接口温度260℃；离子源温度：210℃；电子能量：70eV；扫描速度：2.78s/dec；质量扫描范围(m/z)：40～300amu。
[0025]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0026]本专利技术中，一方面通过采用离子溅射仪观察、拍摄腺毛形貌，采用扫描电镜自带测量功能测量并记录腺毛大小；同时选取两种密度梯度离心法对薄荷叶片盾状腺毛进行分离和富集，用激光捕获显微切割分离富集薄荷盾状腺毛，并对薄荷叶片盾状腺毛进行气相
‑
质谱(GC
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MS/MS)检测分析，激光显微切割技术将激光切割系统与显微光学系统相集成，实现
了对腺毛的精准定位和切割，使得腺毛的分离技术得到极大提升。
附图说明
[0027]图1为薄荷叶片表面盾状腺毛特征示意图；
[0028]图中：A：薄荷植株；B：SEM低倍镜下盾状腺毛；C：成熟盾状腺毛；
[0029]图2为采用密度梯度离心法富集本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种薄荷盾状腺毛富集及内含物鉴定方法，其特征在于：该研究方法具体包括四个步骤，分别为：S1、采用场发射扫描电镜(SEM)对薄荷叶皮盾状腺毛形态进行观察；取干燥薄荷叶片，在叶片基部叶脉周围同一部位取约5mm
×
5mm大小叶片，用导电胶粘附在样品台上，采用离子溅射仪在40mA电流强度下喷金镀膜35s；将喷金镀膜后的样品置于场发射扫描电镜样品仓内，在5～10kV加速电压(EDT)下观察、拍摄腺毛形貌，采用扫描电镜自带测量功能测量并记录腺毛大小；S2、密度梯度离心法分离薄荷盾状腺毛；采用密度梯度离心法对薄荷叶片盾状腺毛进行分离和富集，对分离缓冲液组成配比、分离方法进行优化；S3、建立以激光捕获显微切割分离富集薄荷盾状腺毛的方法学体系；S4、对薄荷叶片盾状腺毛进行气相
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质谱(GC
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MS/MS)检测分析；将LMD切割富集到的盾状腺毛，加入适量乙酸乙酯，超声处理10min，上清液过0.22μm滤膜，上机检测。2.根据权利要求1所述的一种薄荷盾状腺毛富集及内含物鉴定方法，其特征在于：所述S2中的密度梯度离心法具体为：研磨器中加入10g新鲜薄荷叶片，再加入200mL分离缓冲液[25mMMOPSO、200mM山梨醇、10mM蔗糖、5mM硫脲、2mM二硫苏糖醇、5mMMgCl2、0.5mM磷酸钠、0.6％(w/v)甲基纤维素、1％(w/v)PVP]，启动研磨器，研磨条件：5次脉冲，20s/每次，每两次研磨时间间隔2～3min，研磨至叶片中肉眼可见无大块碎片；将研磨所得匀浆过100μm分子筛，去除残渣，用冲洗液(25mMMOPSO、200mM山梨醇、10mM蔗糖、5mM硫脲、2mM二硫苏糖醇、5mMMgCl2、0.5mM磷酸钠)冲洗残留在分子筛滤网上的叶肉组织，共冲洗3～4次，每次用量5～10mL，洗后的溶液合并到滤液中；滤液继续过70μm分子筛，离心，离心条件：4℃，12000rcf，10min；离心液弃去上清液后再加入5mL蒸馏水混合，将所得混合液小心...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘红燕，刘若菡，郑志娟，宿兆飞，刘江亭，巩丽丽，刘谦，张永清，
申请(专利权)人：山东中医药大学，
类型：发明
国别省市：